雷帕霉素在6-羟基多巴诱导的帕金森病细胞及大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究
【摘要】
【作者】蒋建华；
【导师】顾振纶；秦正红；
【作者基本信息】苏州大学，药理学，2013，博士
【目的】帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是中枢神经系统变性疾病，线粒体氧化应激和神经元凋亡在PD的病理机制中发挥关键的作用。雷帕霉素(rapamycin)为雷帕霉素靶蛋白(Targetofrapamycin,TOR)信号通路特异性抑制剂，在一系列神经系统变性疾病的病理机制及治疗中具有重要的意义。本研究通过雷帕霉素预处理PD大鼠及细胞模型，揭示其在PD中的神经保护作用，并探讨其机制。
【方法】动物实验：实验SD大鼠随机分为假手术组、PD模型组、雷帕霉素低剂量组(0.05mg/kg/d)、中剂量组(0.5mg/kg/d)及高剂量组(5mg/kg/d)进行雷帕霉素灌胃预处理。7天后，向模型组和所有雷帕霉素预处理组大鼠脑部右侧纹状体两点定向注射6-羟基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)(4μg/μl,2μl/注射点)诱导建立PD大鼠模型，假手术组大鼠注射生理盐水作为对照。术后第25天各组大鼠均用阿扑吗啡(0.5mg/kg)诱导旋转试验，检测行为学指标；在造模后第28天，各组大鼠经心脏灌注固定，取脑组织进行黑质-纹状体酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase，TH）免疫组化染色及透射电子显微镜观察；检测各组SD大鼠中脑丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)活性；提取脑组织总RNA后，采用RT-PCR方法检测黑质-纹状体内Bax、Bcl-2和p47phox等基因mRNA的表达；同时采用westernblot方法检测黑质-纹状体内Bax、Bcl-2、细胞色素c以及cleavedcaspase-9蛋白质的表达。体外实验：采用不同浓度6-OHDA诱导24h后检测PC12细胞存活率，建立PD细胞模型。不同浓度雷帕霉素预处理PC12细胞3h、6h、12h和24h，100μM浓度6-OHDA诱导24h后，使用CCK-8细胞计数试剂盒检测PC12细胞不同时间点的存活率。采用3μM浓度雷帕霉素预处理6h，100μM浓度6-OHDA诱导24h后，使用丙啶碘化物(Propidiumiodide,PI)单染试剂盒检测雷帕霉素对损伤PC12细胞周期的影响。同时使用AnnexinⅤ-FITC和PI双染试剂盒，通过流式细胞仪检测各处理组PC12细胞凋亡的变化。雷帕霉素预处理6h，6-OHDA诱导1h后，使用含DCFH-DA荧光探针的试剂盒检测各处理组PC12细胞中活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的生成。收集各组PC12细胞，提取细胞总RNA，通过real-timeRT-PCR检测各处理组PC12细胞内P47phox、TH、血红素加氧酶-1(hemooxygenase-1,HO-1)和转录因子NF-E2相关因子2(transcriptionalfactorNF-E2-relatedfactor2，Nrf2)的mRNA表达。
【结果】一、动物实验结果：(1)与模型组相比，各剂量雷帕霉素预处理组大鼠的旋转行为减轻(p<0.05)。(2)与假手术组相比，PD模型组损伤侧黑质部位中TH+细胞数量明显减少(p<0.001)；与模型组比较，各雷帕霉素预处理组大鼠损伤侧TH+细胞数量则明显增加(p<0.001)。(3)模型组黑质-纹状体细胞器结构不清，细胞核皱缩，染色质异常聚集；线粒体体积增大，呈空泡样变，线粒体嵴溶解。而不同剂量的雷帕霉素预处理则明显减轻细胞超微结构的异常。(4)与假手术组比较，PD模型组MDA含量明显升高(p<0.001)，而SOD和GSH-PX的活性明显降低(p<0.001)。与PD模型组比较，经雷帕霉素预处理后，各剂量组MDA的含量均显著降低(p<0.01)，而SOD和GSH-PX的活性较PD模型组升高(p<0.05)。(5)与假手术组相比，PD模型组Bcl-2mRNA水平(p=0.001)明显降低而BaxmRNA水平(p<0.001)明显升高。与PD模型组比较，雷帕霉素预处理升高Bcl-2mRNA水平(p<0.01)，同时降低BaxmRNA的表达(p<0.05)，同时Bcl-2和Bax蛋白的表达与RT-PCR的检测结果相似。(6)与假手术组比较，PD模型组P47phoxmRNA的表达明显升高(p<0.001)，而雷帕霉素预处理显著下调PD大鼠模型中P47phoxmRNA的表达(p<0.01)。在PD模型组中活性caspase-9的表达和细胞色素c的释放比假手术组均明显升高(p<0.001)。与PD模型组比较，不同剂量雷帕霉素预处理均可降低PD大鼠活性caspase-9的表达和细胞色素c的释放(p<0.05)。然而，在雷帕霉素三个剂量组之间，所有研究结果包括旋转行为、TH+细胞数量、氧化应激指标及Bcl-2、Bax、P47phox、细胞色素c和caspase-9的表达均无显著统计学差异。二、细胞实验结果：(1)100μM浓度的6-OHDA处理24小时后，PC12细胞接近半数死亡，其存活率为57.67±9.84%。(2)0.5μM-15μM浓度的雷帕霉素单独作用24h，PC12细胞存活率与空白对照组相比均无统计学差异(p>0.05)，而雷帕霉素单独作用48h和72h则出现抑制PC12细胞存活率的现象。(3)与6-OHDA组相比，当0.5μM-3μM浓度的雷帕霉素预处理PC12细胞3h-12h，明显升高损伤细胞的存活率(p<0.05)。其中，3μM雷帕霉素预处理6h对损伤PC12细胞存活率的改善作用最显著(p<0.01)。(4)与空白对照组相比，6-OHDA使PC12细胞中处于G0/G1期的细胞明显增多(p<0.001)，S期(p=0.001)和G2/M期(p=0.009)细胞则明显减少。而3μM雷帕霉素的预处理后6h后，G0/G1期细胞与6-OHDA组比较显著减少(p=0.018)，S期细胞明显增多(p=0.028)，但G2/M期细胞数量无统计学差异。(5)单加雷帕霉素对PC12细胞的凋亡无明显影响，6-OHDA处理后细胞凋亡较正常细胞明显增多(p<0.001)，而3μM雷帕霉素预处理6h，则明显减少6-OHDA所诱导的细胞凋亡(p<0.05)。(6)单加雷帕霉素对PC12细胞内ROS的水平无明显影响，6-OHDA的诱导使PC12细胞内ROS含量明显增多(p<0.01)，而雷帕霉素预处理则抑制损伤细胞中ROS的生成(p<0.05)。(7)单用3μM雷帕霉素处理正常PC12细胞6h-12h，HO-1和Nrf2mRNA的表达明显升高(p<0.05)，而在处理24h-48h两者的表达又回落至接近0h水平；(8)与正常PC12细胞比较，6-OHDA显著升高PC12细胞中P47phox而降低THmRNA的表达(p<0.05)；与6-OHDA组相比，3μM雷帕霉素预处理6h后，P47phoxmRNA的表达下降而THmRNA的表达明显升高(p<0.05)。与正常对照组比较，6-OHDA可升高PC12细胞中HO-1和Nrf2mRNA的表达(p<0.05)，与6-OHDA组相比，3μM雷帕霉素预处理6h后，则进一步上调HO-1和Nrf2mRNA的表达(p<0.05)。
【结论】雷帕霉素可有效改善PD大鼠模型的行为学症状、降低黑质多巴胺能神经元的丢失和促凋亡分子的表达。在PD细胞模型中证实，雷帕霉素具有提高损伤细胞的生存能力和减少细胞凋亡的生物学作用。细胞周期的改变和抗氧化应激能力的增强可能是其神经保护作用的重要机制。由此，恢复氧化应激中调控信号的平衡可能为PD的药物治疗拓展新的途径。
【关键词】帕金森病；雷帕霉素；神经保护；氧化应激；凋亡；
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