结直肠癌演进过程中CD133分子表达的临床意义及调控机制

【摘要】结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在恶性肿瘤中已上升至第三位,死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国,随着经济的发展和饮食结构的改变,结直肠癌的发病率逐年攀升,已成为危害人民健康的常见疾病之一。虽然近年来对结直肠癌的研究不断深入,治疗手段包括手术、化疗、放疗不断改进,但是复发、转移常导致治疗失败,最终导致患者死亡。大量的研究结果显示,肿瘤细胞具有很大的异质性。肿瘤组织内只有很少量的细胞亚群具有形成新的肿瘤组织的能力,被称之为肿瘤干细胞(CancerStemCells,CSCs)或肿瘤起始细胞(TumorInitiatingCells,TICs)。自1994年Lapidot,T成功从急性粒细胞白血病分离并鉴定出肿瘤干细胞以来,相继在乳腺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等实体肿瘤组织中发现了肿瘤干细胞的存在。与普通肿瘤细胞相比,肿瘤干细胞高表达干细胞相关基因,如Nanog、SHH、NOTCH、HES、oct-4/3等。此外肿瘤干细胞还表达某些标记分子,其中CD133是最重要的标记分子之一。CD133分子是一种五次跨膜的糖蛋白,分子量约为120KD。起初研究发现CD133分子特异性表达在神经干细胞、造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)表面。之后的研究发现CD133分子表达于多种胎儿或成体组织。虽然至今对CD133分子的功能还不明确,但是CD133单独或与其他分子联合已逐渐应用于多种肿瘤干细胞的鉴定和生物学特性研究,如脑胶质瘤、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌等。研究表明结直肠癌组织中CD133的表达显著高于正常组织,并且CD133+细胞在NOD/SCID小鼠体内显示了肿瘤形成能力。继后大量的文献报道了CD133与结直肠治疗、预后的临床研究。结果显示,(1)CD133分子的表达与结直肠癌判断患者生存期的独立因素；(2)CD133分子的表达是肿瘤耐药的重要标记；(3)CD133的表达与肿瘤的临床分期、病理分期以及患者的术后生存期等都具有相关性。还有研究结果显示,结肠癌患者术前经非甾体类抗炎药治疗,能降低肿瘤组织中CD133分子的表达,从而影响患者术后生存期。CD133分子的表达有复杂的调控机制,研究表明结直肠癌细胞异常甲基化可以导致CD133分子表达抑制；而进展期肠癌细胞去甲基化则导致CD133分子表达异常增高；另外有研究发现CD133分子的表达受mTOR信号、低氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor1-α,HIF-1α)信号通路的调控；最近KristelKemper等研究结果显示Ras-Raf调控通路突变可导致CD133分子表达异常增高。此外,UteBissels对造血干细胞的研究发现,在造血干细分化过程中1microRNA-142-3p对CD133分子的表达具有调节作用,表明CD133表达分子还具有转录后调控机制。microRNA是一类长度大约为22bp的小分子RNA,是重要的转录后调控分子。结直肠癌的演进是一个缓慢演变的的过程。大多数结直肠癌经历了正常肠组织、良性息肉、腺瘤、恶性肿瘤的演变过程。在这一过程中,伴随多种microRNA表达的异常变化。大量实验证实microRNA对靶基因表达调控的异常,导致和/或促进了结直肠的发生、发展。综上所述,在结直肠癌演进过程中CD133分子表达变化与肿瘤进程的相关性,CD133分子表达变化的分子调控机制有待进一步研究。鉴此,本课题以结直肠癌这一常见的恶性肿瘤为研究对象,以肿瘤干细胞重要标记分子CD133的表达为切入点,通过研究正常肠组织、息肉/腺瘤、结直肠癌三种组织中CD133分子表达的动态变化及其临床意义,进而探讨结直肠癌演进过程中CD133分子表达异常变化的分子机制。课题旨在通过探讨结直肠癌演进过程中干细胞的动态变化,为结直肠癌的研究及临床治疗提供新思路。第一部分CD133分子在结直肠癌演进过程中的动态表达及临床意义[目的]研究CD133分子在正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中的表达,分析CD133分子在结直肠癌组织表达的临床意义。[方法]选取结直肠癌手术切除标本及配对的远端正常肠组织石蜡包埋标本各158例、良性息肉石蜡包埋标本71例,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测组织中CD133分子的表达。同时收集结直肠癌手术切除新鲜肿瘤标本、远端组织标本各8例、内窥镜下手术切除息肉标本8例,消化酶消化后制备单细胞悬液,流式细胞术(FlowCytometry,FCM)检测CD133分子表达率。统计分析结直肠组织CD133分子表达与患者临床参数间相关性。KaplaneMeier生存曲线分析CD133分子表达与患者生存期之间的关系。[结果](1)免疫组化结果显示正常肠组织、良性息肉、结直肠癌三种组织中CD133染色均显示为典型的胞膜阳性,各组的阳性率分别为5.06%(8/158)、15.49%(11/71)、45.57%(72/158)。三组间CD133阳性率具有显著性差异(P<0.001)。正常肠组织和息肉组织染色显示,阳性细胞为隐窝底部、排列密集的细胞。而肠癌组织中细胞排列紊乱、失去固有组织结构,CD133阳性细胞比例和程度显著强于远端组织或良性病变组织；(2)流式细胞术分析三种组织细胞CD133分子的表达率分别为1.51±0.67%、3.48±1.66%、12.61±6.84%,组间具有显著性差异(p=0.001)。结果显示肠癌组织中CD133表达率显著高于远端组织或息肉组织,与免疫组化结果一致；(3)结合结直肠癌患者临床病理资料分析发现,CD133的表达与肿瘤的病理分期(p=0.033)、淋巴结转移(p=0.001)、远处转移(p<0.001)、TNM分期(p=0.001)具有相关性。KaplaneMeier生存曲线分析发现,CD133-患者中位生存期为71.0月,CD133+患者生存期为36.0月,CD133的表达与患者生存期具有相关性(p=0.001)。[结论]结直肠组织中CD133分子的表达在结直肠癌演进过程中呈上调表达,与结直肠癌的演变具有相关性；并且结直肠组织中CD133分子的表达与肿瘤的病理分期、淋巴结转移、TNM分期以及患者的生存期相关。第二部分结直肠癌演进过程中干细胞相关分子与CD133分子表达的相关性及意义[目的]分析结直肠癌演进过程的不同阶段,CD133分子的表达与肿瘤干细胞另一重要标记分子CD44以及oct-4、klf-4、Sox2、Nanog和c-myc等干细胞相关基因表达的相关性及意义。[方法]选取结直肠癌手术切除标本及配对的远端正常肠组织石蜡包埋标本各158例、良性息肉石蜡包埋标本71例,免疫组织化学检测组织中CD44、oct-4、CD133分子的表达。同时收集结直肠癌手术切除新鲜肿瘤标本、远端组织标本各33例、内窥镜下手术切除息肉标本33例,trizol抽提RNA,Real-timePCR研究oct-4、klf-4、Sox2、Nanog、c-myc等干细胞相关基因在不同组织中的转录差异。收集结直肠癌手术切除新鲜肿瘤标本、远端组织标本各8例、内窥镜下手术切除息肉标本8例,消化酶消化后制备单细胞悬液,流式细胞术检测不同组织细胞oct-4分子表达率。[结果](1)CD44分子在组织细胞膜以及细胞外基质均有表达。正常肠组织、息肉组织染色显示,阳性细胞为隐窝底部、排列密集的细胞；而肠癌组织中细胞排列紊乱、失去固有组织结构,并且阳性细胞比例和阳性程度显著强于远端或良性病变组织CD44分子在结直肠癌演进不同阶段呈上调表达,与CD133分子表达变化一致；(2)在oct-4、klf-4、Sox2、Nanog、c-myc等干细胞相关基因中,oct-4在正常肠组织、息肉组织、肠癌组织中的转录水平逐步升高；免疫组化结果显示,oct-4分子表达于细胞核,呈细胞核染色阳性。在正常结直肠、息肉组织、结直肠癌三种组织中oct-4分子表达逐步上调,并且与CD133分子的表达具有相关性。通过流式细胞术分析三种组织中oct-4表达,结果显示,三种组织中oct-4的表达逐步增高,表达率分别为1.40±0.78%、2.91土1.57%、11.37土6.32%,组间具有显著性差异(p=0.001),进一步验证了免疫组织化学的结果。结直肠癌组织标本连续切片,分别研究CD133、oct-4分子的表达。结果发现,在结直肠癌组织中存在CD133与oct-4分子的共表达。[结论]CD44分子在正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中表达逐步增高,与CD133分子的表达变化一致；结直肠癌演进的不同阶段干细胞相关基因oct-4表达逐步增高,并且与CD133分子表达相关；由此提示,与良性组织相比,结直肠癌组织中不但干细胞标记分子表达增高,而且还上调表达干性相关转录因子,并且这些变化对结直肠癌的演进可能具有重要意义。第三部分microRNA-378对CD133分子的转录后调控机制[目的]生物芯片分析正常肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中microRNA表达差异；生物信息学分析探寻可能对CD133分子具有转录后调控作用的microRNA。构建Dualluciferaseassay报告质粒,luciferaseassay证实microRNA对CD133分子转录后调控作用。[方法]收集33例结直肠癌手术切除新鲜肿瘤标本、远端组织标本、息肉标本,Real-timePCR研究不同组织中CD133分子的转录水平。生物芯片分析6例正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌三种组织中microRNA的差异表达。生物信息学分析可能与CD133分子3‘UTR具有潜在结合位点的microRNA,及其结合位点序列。RT-PCR扩增CD133分子3’UTR全长片段,构建CD133/3’UTR-pGL3双荧光报告载体,通过酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定后,Luciferaseassay研究microRNA378对CD133分子表达的调控作用,同时以microRNA142-3p作为阳性对照。在此基础上合成野生型、突变型microRNA378结合片段,构建w378/pGL3和m378/pGL3双荧光报告质粒,luciferaseassay进一步研究确定microRNA378对CD133分子表达的调控作用。最后,结直肠癌细胞株HCT116体外转染microRNA378,流式细胞术研究转染前后HCT116表面CD133分子表达变化,验证]microRNA378对CD133分子表达的调控作用。[结果](1)与蛋白水平不同,在正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中CD133分子mRNA转录水平没有显著性差异(p>0.05)；(2)对正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中microRNA表达分析显示,包括microRNA378在内,结直肠癌组织中有8条microRNA表达显著下降；(3)通过生物信息学分析,发现microRNA378与CD133分子3‘UTR具有潜在的结合位点；(4)成功构建了包含CD133分子3’UTR全长片段的双荧光报告载体,CD133/3’UTR-pGL3。luciferaseassay结果显示microRNA378能有效抑制报告质粒荧光素酶的表达,抑制效率与阳性对照microRNA142-3p相似；(5)成功构建包含野生型、突变型microRNA378结合位点的双荧光报告载体w378/PGL3、m378/PGL3,分别通过luciferaseassay研究发现,microRNA378能有效抑制w378/PGL3报告载体荧光素酶的表达,对m378/PGL3报告质粒无显著作用；(6)体外转染microRNA378后,显著抑制结直肠癌细胞株HCT166表面CD133分子表达,并且抑制作用具有剂量依赖性。[结论]在正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中CD133分子mRNA转录水平没有显著性变化,提示CD133分子在结直肠癌组织中异常表达受转录后调控；microRNA378在结直肠癌演进过程中表达逐步下降,microRNA378对CD133分子表达具有转录调控作用。由此提示,结直肠癌演进过程中1microRNA378表达抑制是导致CD133分子表达异常增高的分子机制之一,值得进一步深入探讨。综上所述,本研究获得以下研究结果：(1)发现正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中CD133分子表达逐步增高,CD133分子的表达与结直肠癌的演进具有相关性；同时结果还显示,结直肠组织中CD133分子的表达与肿瘤的病理分期、TNM分期、远处转移、淋巴结转移、患者生存期等病理因素具有相关性,提示CD133分子在结直肠癌演进过程表达分析具有潜在的临床应用价值。(2)证实正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中,CD44分子呈上调表达,与CD133分子表达一致。进而证实在结直肠癌演进过程中,干细胞相关基因oct-4的表达逐步增高,与CD133分子的表达具有相关性,并且在结直肠癌组织中两者有共表达。(3)揭示正常结直肠组织、息肉组织、结直肠癌组织中CD133分mRNA转录水平没有显著变化；结直肠癌演进过程中共有8条microRNA表达显著下降,通过生物信息学分析、dualluciferaseassay、体外转染等实验,首次证实microRNA378对CD133分子具有转录后调控作用。实验提示,CD133分子具有转录后调控机制,结直肠癌演进过程中microRNA378表达抑制可能是CD133分子异常表达的重要调控机制之一,值得深入探讨。鉴此,结直肠癌演进过程中存在与肿瘤发生、发展相关的干细胞异常变化,CD133分子是其重要的标记分子,其异常表达受转录后调控。研究结果为结直肠癌干细胞的研究和临床肿瘤干细胞干预提供新的途径。
【作者】周桓；
【导师】张学光；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2013，博士
【关键词】结直肠癌；肿瘤干细胞；CD133；CD44；oct-4；mnicroRNA；

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