新颖亲和整体柱的设计、制备和应用

新颖亲和整体柱的设计、制备和应用

作者:师大云端图书馆 时间:2015-09-15 分类:期刊论文 喜欢:4149
师大云端图书馆

【摘要】顺式二羟基生物分子在生命科学领域中分布广泛,并发挥着非常重要的作用。其包括糖类化合物、儿茶酚胺类化合物、核苷类、糖蛋白等生物分子,许多该类的生物分子已经成为疾病诊断的重要生物标志物,但是它们的样品基体十分复杂,且本身的丰度通常很低。因此,如何对这些重要的生物分子进行富集和分离成为生命分析化学研究中的巨大挑战。硼亲和材料以其可逆的pH调控特点,在顺式二羟基生物分子的分析中发挥了重要作用。但是,目前的硼亲和材料仍存在一些不足,比如基体材料的亲水性差,对顺式二羟基生物分子结合力低等。虽然硼酸功能化材料对顺式二羟基生物分子特别是糖蛋白,展现出了独特的pH响应可逆抓取和释放的能力,但仅限于糖蛋白的富集和分离,而对非糖蛋白却无能为力。另外,在多孔的亲和分离材料中,纳米孔的限域效应经常被认为是一种不利的因素。然而,近些年来,纳米尺寸限域效应的正面作用逐渐显露出来。鉴于纳米孔能够对与其尺寸相当的蛋白质产生限制作用,纳米限域效应可能成为一个新的设计和制备蛋白质亲和材料的元素。针对硼亲和功能化材料亲水性差的问题,我们利用具有良好亲水性的硅胶材料,制备了硼亲和有机-硅胶杂化整体材料。选择了3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)作为硼酸功能单体,一是因为AAPBA的亲水性远高于乙烯基苯硼酸(VPBA);二是因为硼亲和色谱一般在pH≥pKa(硼酸单体)的条件下,才能对顺式二羟基化合物进行富集,而单体AAPBA的pKa(8.2)相对较低,因此可以在硅胶柱所允许的pH范围内使用。实验结果表明,该整体柱能够在pH6.5的弱酸性条件下对顺式二羟基化合物进行选择性富集,而无需添加有机溶剂抑制非特异作用,非常适用于生理样品分析。该整体柱的柱容量是目前报道的硼亲和整体柱中最高的,这可以归因于该整体柱具有较大的比表面积。此外,该整体柱具有明显的次级分离能力,可以在一根柱子上实现二维(2D)分离。基于该性质,我们建立了离线的2D-CLC(毛细管液相色谱)-CE(毛细管电泳)分析平台,并成功用于尿样中修饰核苷的分离。针对硼亲和材料对顺式二羟基生物分子结合力低的问题,我们选择了2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸(DFFPBA)作为功能单体,一是因为其具有超高的硼亲和力,二是由于该单体具有相对较低的pKa值(6.5)。实验结果表明,制备得到的DFFPBA-功能化整体柱不仅对顺式二羟基生物分子具有超高的硼亲和力;同时,具有合适间隔臂长度的DFFPBA-功能化整体柱能够在pH6.0的条件下对顺式二羟基生物分子进行抓取。另外,间隔臂长度对硼亲和力具有明显的影响:随着间隔臂长度的增加,硼亲和力逐渐降低,不合适的间隔臂长度会导致硼亲和柱不能抓取糖蛋白。我们对这个独特现象的形成机制进行了推测。最后,DFFPBA-功能化整体柱被用于选择性富集人尿样中的修饰核苷。鉴于硼亲和材料优越的pH调控性能和仅能用于富集和分离糖蛋白的限制,以及在纳米孔限域效应方面的深入理解,我们提出了一种纳米限域策略用于发展具有pH响应性能的新颖亲和材料。通过该策略,设计合成了两种纳米限域亲和材料。该类材料不仅表现出了类似硼亲和的pH调控结合和释放目标分子的性质,而且将结合物质拓展到了非糖蛋白,为硼亲和材料提供了有力的互补工具。该材料表现出以下特点和优势:第一,能够在pH≥6.0的条件下结合分子量大于18kDa的蛋白质,当环境切换为pH<3.0时被抓取的蛋白质又能被可逆地释放出来;第二,与三种测试蛋白质之间的解离常数在10-5-10-7M范围内;第三,能够很好地保持被抓取蛋白质的构型和活性,可以作为一种普适性载体用于制备蛋白质功能化材料,比如基于蛋白质的手性分离柱和固载酶反应器;第四,可用于血清中高丰度蛋白质的去除,在蛋白质组学中展现了良好的应用前景。如果制备得到具有窄孔径分布的纳米孔材料,将有可能实现纳米限域亲和材料的尺寸特异性,可以与蛋白质印迹材料媲美。该纳米限域策略为合理设计独特的功能化材料开辟了新的思路。
【作者】李前进;
【导师】刘震;
【作者基本信息】南京大学,分析化学,2014,博士
【关键词】硼亲和色谱;整体柱;苯硼酸;含氟苯硼酸;顺式二羟基生物分子;核苷;糖蛋白;蛋白质;纳米孔;限域效应;

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