不同启动子和插入位点表达AIV-H9 HA抗原的重组马立克氏病病毒的构建和比较研究

【摘要】马立克氏病病毒(Marek’sDiseaseVirus,MDV)GX0101株是我们实验室在2001年从广西某鸡场中分离到一株带有禽网状内皮组织增生症病毒（REV）长末端重复序列（LTR）的1型MDVGX0101，其致病型为超强毒。将该毒株构建成细菌人工染色体（BAC）克隆，并在此传染性克隆的基础上进行了一系列的研究。其中敲除了GX0101两个致肿瘤基因Meq，构建了Meq缺失株GX0101ΔMeq，通过动物实验证明该突变株不仅失去了鸡群的致病性和免疫抑制，而且还可以对鸡群起到很好的保护性免疫作用，其保护效果要超过CVI988疫苗。本研究在GX0101ΔMeq的基础上，将该突变株作为载体表达H9N2禽流感病毒的HA基因，构建了不同的重组病毒并对这些重组病毒进行了体外和体内的研究。1抗H9N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H9N2-HA真核表达载体的构建本研究中构建了9株以GX0101ΔMeq为载体表达H9N2-HA的重组病毒。为了验证重组病毒中HA基因在体外的表达，首先制备了H9N2禽流感HA的鼠多克隆抗体，用于后续研究中HA基因在重组MDV表达的检测。然后又构建表达H9N2-HA的重组病毒，首先我们需要构建能够在真核系统中表达HA基因的真核表达质粒。将整段HA基因的ORF克隆到以CMV为启动子的真核表达载体pcDNA3.1（-）中，并将该真核表达质粒转染CEF细胞，以上述制备的HA抗体作为一抗用IFA验证真核表达质粒中HA在CEF中的表达。结果显示,IFA可以检测到CEF细胞中HA蛋白的存在，证明本研究中构建的HA真核表达质粒能够成功表达HA基因，可以用于后续研究。2应用RedE/T重组系统和Flp/FRT重组系统以两步重组法构建一株以GX0101ΔMeq为载体表达H9N2-HA基因的重组病毒rGX-CMV-HA本部分研究主要解决构建重组MDV的方法学问题。我们的研究先后尝试了不同方法用于构建重组MDV，这些方法包括真核细胞上的同源重组、在BAC系统中的RedE/T重组（应用Counter-SelectionBACModificationKit试剂盒）、在BAC中利用RedE/T重组系统和Flp/FRT重组系统，经过近1年半的时间对构建重组MDV的方法学的探索，我们建立一种非常方便的构建重组MDV的方法。首先在HA基因表达盒前引入Kanr抗性筛选基因，然后利用RedE/T重组系统在大肠杆菌EL250中将这段带有抗性筛选基因的HA表达盒作为外源插入片段整合到GX0101ΔMeq载体质粒上，再利用Flp/FRT重组系统在L-阿拉伯糖的诱导下将Kanr抗性筛选基因从重组子中敲除掉。将通过验证完全敲除了Kanr抗性筛选基因的重组质粒prGX-CMV-HA从EL250大肠杆菌中提取出来，转染CEF细胞拯救病毒，并通过IFA验证重组病毒中HA基因的表达。结果表明，通过这种两步重组法，我们成功获得了重组病毒rGX-CMV-HA，并且IFA验证HA基因在重组病毒感染的CEF中成功表达。3以GX0101ΔMeq为载体的重组MDV中不同启动子转录H9N2-HA基因的活性比较为了研究不同的启动子在重组MDV中转录HA基因的活性，本研究中以GX0101ΔMeq为载体，利用前期探索的两步重组法，在已经构建好的重组病毒rGX-CMV-HA的基础上又构建了4株不同的重组病毒。这些重组病毒分别用了5个不同的启动子转录HA基因，这5个启动子包含3个内源启动子和2个外源启动子，内源启动子是来自GX0101ΔMeq载体自身的gB基因启动子(gB)和另一个来自GX0101ΔMeq载体自身的位于PP38和1.8kbRNA转录子之间的双向启动子的两个方向，即PP38方向（pPP38）和1.8kbRNA转录子方向（p1.8kb）。外源启动子分别为CMV启动子和SV40启动子。我们对这5个不同的重组病毒进行了体外和体内的比较研究，结果显示，在细胞培养中,重组病毒rGX-CMV-HA中HA基因转录水平最高，rGX-SV40-HA和rGX-p1.8kb-HA两者转录外源基因的能力几乎在同一水平，其他两个内源启动子pPP38和gB在重组病毒中转录HA基因的水平较低，其中rGX-pPP38-HA处在最低的水平。双向启动子的两个方向pPP38和p1.8kb的转录水平差异较大，rGX-p1.8kb-HA的转录水平要明显超过rGX-pPP38-HA转录HA的水平。动物实验证明，5个重组病毒均可以在体内复制，但均不能诱发机体产生抗体，rGX-CMV-HA，rGX-SV40-HA，rGX-p1.8kb-HA均不能对鸡群起到保护效果。而重组病毒rGX-gB-HA的有25%的鸡得到保护，重组病毒rGX-pPP38-HA可以给感染鸡提供50%的保护。4重组病毒中GX0101ΔMeq载体上的不同插入位点对表达HA外源基因的影响为了研究GX0101ΔMeq载体上的不同插入位点对表达HA外源基因的影响，我们根据不同启动子在重组GX0101ΔMeq中转录HA基因活性大小的研究结果，选择处于中等转录活性强度的双向启动子的1.8kb转录子方向（p1.8kb）作为启动子转录HA基因，同时选择了GX0101ΔMeq载体上病毒复制非必须区US2、US10、Meq以及BAC骨架上的gpt基因位点作为靶位点，分别将HA表达盒整合到这些区域，将这些构建的重组病毒rGX-US2-HA，rGX-US10-HA，rGX-Meq-HA和rGX-gpt-HA感染CEF细胞，利用ELISA和荧光定量RT-PCT分别研究这些病毒在细胞培养上表达HA蛋白水平和转录mRNA水平的差异。通过接种鸡的实验研究这些不同重组病毒对鸡群的保护效果。结果显示，在细胞培养上，在GX0101ΔMeq载体上的不同位点表达外源HA基因无论是在蛋白水平还是在mRNA水平上都有差异，在US2区表达外源基因的活性最强，其次是US10和Meq区，我们所选择的外源插入gpt位点表达HA基因的能力最弱。体内试验结果显示，4株重组病毒均可以在体内复制，但是都不能诱发可检测到的血清中针对H9N2的抗体。重组病毒rGX-US2-HA、rGX-US10-HA和rGX-gpt-HA对SPF鸡没有任何保护效果，但重组病毒rGX-Meq-HA对H9N2人工感染鸡有60%的保护作用。
【作者】马诚太；
【导师】崔治中；
【作者基本信息】山东农业大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】马立克重组病毒；H9N2-HA基因；启动子；表达水平；免疫保护；

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