稳定消减MK5增强阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的研究

【摘要】肝癌和胰腺癌均为临床上最常见的消化系统恶性肿瘤,它们的恶性程度高、发展进程快、转移性强、死亡率高。由于肝癌及胰腺癌发病初期症状隐匿、有效的早期检测方法匮乏,当患者出现明显症状并确诊时,病情往往已经发展至中晚期。手术切除是肝癌及胰腺癌治疗的最佳方案,但是在手术切除方案不能施行的情况下,化学药物疗法成为了主要的治疗手段。阿霉素是临床常用的肝癌治疗药物,曾被认为是最有效的肝癌化疗药物之一。然而,阿霉素除具有较强的心脏毒性作用外,也面临着日益严重的肝癌细胞耐药性导致的疗效下降的难题。而胰腺癌的5年生存率仅为5%,其中胰腺导管癌约占胰腺癌总数的75%-92%,因此,胰腺导管癌是胰腺癌研究的重点。尤为突出的是,临床上专门用于治疗胰腺导管癌的药物相对较少,对其他肿瘤有效的药物在胰腺导管癌治疗中往往难以奏效。本研究的第一部分主要探讨MK5在阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。MAPKAPK5(MK5),又名p38调节／激活的蛋白激酶(p38-regulated/activatedproteinkinase,PRAK).尽管有实验证据提示MK5的mRNA水平在正常肝组织与肝癌组织中存在差异,但MK5与肝癌发生发展机制的关系却并不明确。本研究中,我们首先比较了MK5在人肝癌及其癌旁组织样本中的蛋白含量,结果显示,MK5蛋白在肝癌样本中呈高丰度表达。随后,我们采用基因扰动的方式,分别在肝癌细胞株HepG2及Hep3B中构建了过量表达MK5的稳定细胞株,以及消减内源MK5的稳定细胞株。结果显示,MK5蛋白表达水平的变化对肝癌细胞在正常培养条件下的细胞周期及增殖速率无显著影响。但是,过量表达MK5能够提高肝癌细胞在阿霉素处理条件下的存活率,而消减内源MK5表达能够降低阿霉素处理下的肝癌细胞存活率。过量表达或消减内源MK5对其他化疗药物(如喜树碱、长春新碱及紫杉醇)处理条件下肝癌细胞株的存活能力没有影响。进一步的研究结果显示,MK5能够通过蛋白酶体降解,其过程能够被阿霉素所促进。此外,过量表达MK5能够削弱阿霉素诱导的肝癌细胞的凋亡,而消减内源MK5能够增加肝癌细胞对阿霉素处理的敏感性(肝癌细胞凋亡率约增加25%-40%)。本文的第二部分是寻找和探讨治疗胰腺癌的药物靶标。脑特异性表达激酶2(Brain-specifickinase2,BRSK2)是AMPK(AMP-activatedproteinkinase)家族成员之一。本实验室早期工作证实,BRSK2蛋白在胰腺导管癌细胞PANC-1以及胰腺导管癌组织中高丰度表达,它是PANC-1细胞耐受恶劣环境(如糖饥饿)的重要因子。因此,BRSK2是潜在的胰腺导管癌治疗靶标,而寻找BRSK2调控机制对胰腺导管癌治疗也具有重要意义。本研究中,我们通过酵母双杂交方式,发现了一个新的与BRSK2相互作用的蛋白Jabl(c-Junactivationdomain-bindingprotein-1)。据文献报道,Jabl能够促进多个蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解,此外,Jabl也能够参与细胞周期进程的调控。我们首先对BRSK2及Jabl在多种肿瘤细胞株中的蛋白表达情况进行了检测。结果显示,Jabl在肿瘤细胞株中广泛表达,而BRSK2仅在胰腺导管癌PANC-1细胞中高丰度表达,在HeLa细胞及HEK293T细胞中有少量的表达。通过GSTpull-down及免疫共沉淀实验,我们证实了BRSK2与Jabl能够在体外及生理水平相互结合。免疫荧光共定位实验结果显示,BRSK2与Jabl在细胞内存在共定位现象。我们证实了Jabl能够提高BRSK2的体内泛素化水平并且促进BRSK2蛋白通过蛋白酶体降解。此外,外源表达BRSK2能够诱导肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期,而外源过量表达Jabl可以逆转BRSK2诱导的G2/M期阻滞。综上所述,我们的研究第一次发现MK5蛋白在肝癌组织中呈现高丰度表达,我们证实了稳定消减MK5能够增强阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡。另一方面,我们发现了胰腺导管癌中高丰度表达蛋白BRSK2的一个新的互作分子Jab1并证实Jab1能够促进BRSK2通过蛋白酶体降解。本项研究为肝癌细胞株阿霉素耐药性机制研究提供了一个新的研究思路,也发现并证实了BRSK2是胰腺导管癌潜在治疗靶标,它与Jab1的互作关系也为胰腺导管癌治疗提供了新的线索。
【作者】周君；
【导师】余龙；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2012，博士
【关键词】MK5；BRSK2；肝癌；胰腺导管癌；蛋白酶体降解；

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