肥胖和2型糖尿病治疗药物对3T3-L1细胞NALP3炎症复合体的作用及机制研究

【摘要】目的：肥胖和2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)严重威胁着人类健康,而且两种疾病常合并发生。然而,肥胖与T2DM的发病机制尚未明确。肥胖与T2DM同属于代谢性炎症性疾病,其发病机制必然与炎症反应相关,NALP3炎症复合体是近年来发现的一种大分子炎症因子,并且参与调节机体内与肥胖和T2DM紧密相关的炎性介质白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)。本研究通过检测格列苯脲(glibenclamide,G)、瑞格列奈(repaglinide,R)、伏格列波糖(voglibose,V)、二甲双胍(metformin,M)、西格列汀(sitagliptin,S)、罗格列酮(rosiglitazone,Rosi)、奥利司他(orlistat,0)这些肥胖和T2DM治疗药物对3T3-L1细胞内NALP3炎症复合体水平的影响,验证NALP3炎症复合体与肥胖和T2DM的关系,初步筛选出对NALP3炎症体有抑制作用的药物,继而进一步检测这些药物作用下,NALP3炎症复合体上游激活因子泛连接蛋白-1(Pannexin-1)、组织蛋白酶B(cathepsinB)、硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxininteractingprotein,TXNIP)、核因子活化B细胞K轻链增强子(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedBcells,NF-κB)的以及其下游炎性介质IL-1β、IL-18(interleukin-18,IL-18)和其他与肥胖和T2DM密切相关的白介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)水平的变化,另外,因为本次研究的实验对象是3T3-L1细胞,通过文献学习及补充实验西格列汀对3T3-L1细胞分化的影响,观察药物对3T3-L1细胞分化的影响和对NALP3炎症复合体水平的影响有无一致性,通过以上研究初步探讨肥胖和T2DM治疗药物对NALP3炎症复合体水平影响的可能机制。研究方法：将3T3-L1细胞进行常规培养,药物对NALP3及其相关因子影响实验设定分组为空白对照组、M4mmol/L(mM)、G200μmol/L(μM)、R60μM、V300μM、015μM,S20nM,,Rosi40μM,待细胞密度>90%后48h进行诱导分化,同时按分组设定予以各组药物作用,10天后细胞诱导分化成功,提取mRNA行real-timePCR测定细胞中NALP3复合体各组分NALP3、ASC、caspase-1以及其上游激活因子Pannexin-1、cathepsinB、TXNIP、NF-κB的mRNA表达,取200μl细胞培养基上清行酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),测定IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的浓度,观察NALP3复合体及其上下游相关因子在不同药物作用下的表达情况。西格列汀对3T3-L1细胞分化影响实验设定分组为空白对照组、S5nM、S10nM、S25nM、S50nM、S100nM,先用CCK8法检测西格列汀在该浓度范围内对细胞活性没有影响,之后细胞常规培养至密度>90%,在各浓度西格列汀作用下诱导分化,10天后诱导分化成功,用油红0染剂染色,在显微镜下观察细胞分化程度,测定0D值行半定量法检测,并用real-timePCR检测细胞内与分化相关的过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ,PPARγ)、脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase,LPL)、CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-bindingproteinα,C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(fattyacid-bindingprotein4,FABP4)水平变化。结果：(一)200μM格列苯脲、60μM瑞格列奈、300μM伏格列波糖、4nM二甲双胍、20nM西格列汀、40μM罗格列酮、15μM奥利司他对3T3-L1细胞内NALP3复合体各组分NALP3、ASC、caspase-1mRNA的表达均有不同程度的抑制作用；(二)200μM格列苯脲、60μM瑞格列奈、300μM伏格列波糖、4nM二甲双胍对NALP3炎症复合体上游因子pannexin-1、cathepsinB、TXNIP和NF-κBmRNA的表达均有不同程度的抑制作用,15μM奥利司他对pannexin-1、cathepsinB和NF-κBmRNA的表达有抑制作用,对TXNIPmRNA的表达无明显作用,20nM西格列汀对cathepsinB、TXNIP和NF-κBmRNA的表达有抑制作用,对pannexin-1mRNA的表达无明显作用,40μM罗格列酮对pannexin-1、TXNIP和NF-κBmRNA的表达有抑制作用,同时上调cathepsinBmRNA的表达；(三)200μM格列苯脲、60μM瑞格列奈、300μM伏格列波糖、4nM二甲双胍、20nM西格列汀、40μM罗格列酮、15μM奥利司他对3T3-L1细胞培养基上清内炎性介质IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的分泌均有不同程度的抑制作用。(四)西格列汀在lOnM、50nM、100nM浓度下对3T3-L1细胞分化均有抑制作用,并下调与3T3-L1细胞分化相关基因PPARγ、LPL、C/EBPα、FABP4mRNA的表达。(五)通过已报到的罗格列酮、格列苯脲促进3T3-L1细胞分化,而实验所示西格列汀抑制3T3-L1细胞分化,且各药物对NALP3炎症复合体均有抑制作用,说明药物对3T3-L1细胞分化的影响和对NALP3炎症复合体水平的影响没有一致性。结论：我们的研究筛选出抑制3T3-L1细胞内NALP3复合体的表达的药物,这些药物包括格列苯脲、瑞格列奈、伏格列波糖、二甲双胍、西格列汀、罗格列酮和奥利司他,并发现这些药物同时抑制炎性介质IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的分泌,初步阐明该作用可能与调节上游激活因子pannexin-1、cathepsinB、TXNIP和NF-κBmRNA的表达相关,而与对3T3-L1细胞分化的作用没有一致性。
【作者】孙瑞雪；
【导师】邓洁英；朱惠娟；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】NALP3肥胖；2型糖尿病；药物；

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