利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学鉴定系统性淀粉样变类型

【摘要】背景及目的：福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本结合蛋白质组学技术可以利用院内丰富的病理组织资源进行研究,但目前尚无标准的蛋白提取策略。我们应用当前五种常用的蛋白提取液,对大鼠不同脏器的FFPE微切标本进行蛋白组成分析,从而确定出最佳的能用于后续淀粉样变质谱分型的蛋白提取液。淀粉样变是由致淀粉样变蛋白在细胞外异常沉积所导致的一组疾病,不同亚型的发病机制、疾病进程、治疗手段及预后均有显著差异,因而准确的系统性淀粉样变分型是疾病治疗的先决条件。由于抗体类型有限、标本处理后抗原表位丢失和杂质蛋白干扰等因素,传统的免疫组化法(IHC)诊断淀粉样变亚型并不理想。以质谱为基础的蛋白质组学手段,通过鉴定病灶部位的全部蛋白类型,并根据丰度高低判断致淀粉样变蛋白种类,从而实现亚型鉴定已经成为新的诊断方法。在本研究中,我们试图探讨利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD/MS)方法对系统性淀粉样变进行分型的可行性,比较质谱诊断与免疫固定电泳(IFE)、血清游离轻链(FLC)诊断的准确性差异,以及质谱在不同组织类型中分型的成功率。方法：应用含有Zwittergent3-16、SDS、PEG20000、尿素的四种蛋白裂解液及FFPE-FASP蛋白提取试剂盒对大鼠脑、心脏、肾脏、肝脏及肺组织FFPE显微切割标本进行蛋白提取,根据鉴定多肽数、蛋白数、谱图数、蛋白丰度确定出最优裂解液并用于淀粉样变质谱分型。收集北京协和医院2000年1月至2014年5月期间病理确诊为系统性淀粉样变的133例患者的FFPE病理标本。切片行刚果红染色后,利用LMD收集染色阳性区域组织。选取最佳裂解液进行蛋白提取后行质谱分析,根据丰度最高的致淀粉样变蛋白确定淀粉样变亚型。结果：在微切标本中,含有Zwittergent3-16的裂解液在鉴定多肽数、蛋白数及蛋白丰度上都具有明显优势,且不对酶切及质谱过程产生干扰,因而将Zwittergent3-16裂解液用于淀粉样变受累组织的蛋白提取。在拟行淀粉样变分型的133例患者标本中,腹壁脂肪占27%,舌体占20%,齿龈占11%,肾脏占9%,胃肠道占8,心脏占6%,骨髓及肝脏各占5%,其余类型样本共占9%。116例(87%)获得成功分型,分别为λ轻链型52例(39%),κ轻链型49例(37%),ATTR型7例(5%),AA型2例(2%),AH/AL+AH型2例(2%),AFib型2例(2%),AApoA-Ⅱ型及ALys型各1例(2%)。另有5例患者可排除系统性淀粉样变诊断,8例患者分型失败,4例患者分型不明确。7例ATTR型淀粉样变中,2例基因检测分别为Gly47Arg和Glu54Lys突变,1例患者受累神经免疫组化TTR阳性,其余患者未行基因检测。因此,LMD/MS的总体诊断准确率为91%。在AL型淀粉样变患者中,血清蛋白电泳(SPEP)、IFE和FLC诊断的敏感性分别为23.6%、55.0%及63.9%,特异性分别为92.3%、70.6%及77.8%。而联合IFE及FLC的诊断敏感性为69.4%,特异性55.6%。在LMD/MS分型中,常见受累器官,如心脏、肾脏、肝脏、舌、胃肠道等分型成功率均达到或接近100%。而腹壁脂肪组织的分型成功率仅为86%。结论：Zwittergent3-16裂解液是提取FFPE微切组织蛋白的最佳裂解液。较之血清学检测及IHC,LMD/MS能更为有效地鉴定出系统性淀粉样变亚型,采用受累器官的活检组织标本可进一步提高分型成功率。
【作者】沈恺妮；
【导师】周道斌；李剑；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】系统性淀粉样变；激光显微切割；质谱蛋白质组学；免疫组化；免疫固定电泳；

【参考文献】
[1]张帆.莱钢3~#焦炉热工模型控制[J].冶金自动化,2000,05:70.
[2]蔡耀泽.量化服务在券商行业的应用与分析[D].西南交通大学,工商管理,2014,硕士.
[3]阳一舟.当代农民生活方式的变化研究[D].湖南师范大学,社会学,2013,硕士.
[4]林家乐.饱和潜水信息管理系统设计与实现[D].大连海事大学,交通运输工程,2013,硕士.
[5]黄亚群.政策性金融与民族地区农业现代化发展研究[D].中南民族大学,中国少数民族经济,2013,硕士.
[6]郝占刚,王正欧.基于模式聚类和遗传算法的文本特征提取方法[J].计算机应用,2005,07:1632-1633+1637.
[7]卜望飞.思想政治教育视域下的大学生恋爱观教育研究[D].重庆工商大学,思想政治教育,2014,硕士.
[8]刘启和.基于Rough集的知识发现及其在汉语处理中的应用[D].电子科技大学,2005.
[9]袁亚信.MTC公司风电设备营销策略研究[D].安徽大学,工商管理,2014,硕士.
[10]罗强,易凤莲,张强,唐斌,邱毅,冉曾令.Ⅳ族FCC晶体基态结构和电子性质第一性原理研究[J].原子与分子物理学报,2015,01:153-157.
[11]程娟.青岛市建筑领域可再生能源发展战略研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[12]丁进.移动床生物膜反应器同步硝化反硝化脱氮性能研究[D].安徽大学,环境科学,2014,硕士.
[13]陈东红.基于PLC仿真实训软件系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[14]帅晓丹.甘油法环氧氯丙烷高盐废水处理技术研究[D].华东理工大学,环境科学与工程,2014,硕士.
[15]罗春风,程时杰,熊兰,文劲宇,张有兵,杨慧敏.低压电力线OFDM载波通信系统符号定时同步方法[J].电力系统自动化,2005,09:65-71.
[16]杨杏.语义对等网及其知识资源的组织方法研究[D].西安电子科技大学,情报学,2013,硕士.
[17]符磊.年轻中子星自旋演化的研究[D].南京大学,天文学,2014,博士.
[18]姚利娟.研究性学习思想在高中语文课堂教学中的渗透[D].江西师范大学,教育,2003,硕士.
[19]聂晶晶.幼儿环境空间研究[D].河北大学,艺术（专业学位）,2014,硕士.
[20]徐凤先.基于积极心理学的发展性艺术治疗研究[D].山东艺术学院,艺术学,2012,硕士.
[21]樊浩.民用建筑中集中空调控制系统工程设计方法的研究[D].西安理工大学,电气工程,2003,硕士.
[22]杨彦豪,周建,温晓贵,严佳佳.杭州软黏土非共轴特性的试验研究[J].岩土力学,2014,10:2861-2867.
[23]赵萍萍.利率市场化改革背景下我国利率传导机制效应研究[D].浙江工商大学,西方经济学,2013,硕士.
[24]孙牧文.国有上市公司董事会特征对高管薪酬绩效的影响研究[D].东北农业大学,会计学,2013,硕士.
[25]蔡如繁,茹巧美,何晋浙.乳制品中非法保鲜剂硫氰酸钠检测方法的研究[J].中国乳品工业,2013,04:48-51.
[26]范婷婷.《计算机基础》课程模块化教学的研究与应用[D].渤海大学,现代教育技术（专业学位）,2014,硕士.
[27]付松洁.基于WEB的远程教育资源系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[28]杨子鹿.不同的观点采择条件下自我—他人重叠对助人行为的影响[D].湖南师范大学,应用心理（专业学位）,2014,硕士.
[29]季金山.电网高次谐波的修正机理与设计[D].天津理工大学,控制工程,2013,硕士.
[30]侯一明.中国劳动密集型制造业集聚研究[D].吉林大学,区域经济学,2013,硕士.
[31]钱永胜.生态城市系统管理研究[D].大连理工大学,2001.
[32]王吉庆.静止同步补偿器的非线性控制策略研究[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[33]胡克珍,刘子云,张超谟.人工神经网络在油层对比中的应用[J].石油地球物理勘探,1995,06:811-816+848.
[34]邸伟娜.农村薄弱高中存在的问题与对策研究[D].河北大学,教育管理,2013,硕士.
[35]刘晓冰.江西省高职院校学生职业道德教育的研究[D].江西农业大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[36]江捷.一种在AutoCAD下的组态工具软件的设计方法[J].冶金自动化,1999,03:52-54.
[37]罗跃辉.车辆牵引力、速度与滑转率相关性研究[D].河南科技大学,车辆工程,2013,硕士.
[38]王彦聪.和林格尔县农村信用合作联社发展战略研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[39]邱玉洁.生物医学磁共振中的模式识别方法[D].中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）,2005.
[40]张逸远.椎弓根钉固定结合经椎弓根植骨治疗伴有上终板损伤的胸腰段骨折[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[41]雍小花.中国共产党推进服务型政党建设的路径研究[D].兰州大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[42]郑仁朝,王天真,黎小军,郑裕国.摩氏摩根菌ZJB-09203酯酶的分离纯化及性质[J].生物工程学报,2014,01:129-138.
[43]王漠.志愿服务中的权利义务分析[D].上海大学,思想政治教育,2014,硕士.
[44]宋庆奎,钟建华,吴国军.转炉托圈设计中减少热应力的途径[J].一重技术.1998(04)
[45]张维杰.经蝶手术入路治疗生长激素型垂体腺瘤的临床研究[D].大连医科大学,神经外科学,2012,硕士.
[46]张嵘峰.PMMA银纹破坏的非线性力学行为研究[D].武汉理工大学,结构工程,2004,硕士.
[47]李晓伟.小学英语实习教师课堂教学技能的研究[D].首都师范大学,小学教育,2014,硕士.
[48]许旺土.综合快捷货运服务网络运输能力计算方法研究[D].北京交通大学,2010.
[49]仲伟明.宽带多媒体卫星星上IP交换技术研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[50]古力米热·热孜.长期大风对霸王和木本猪毛菜叶解剖结构的影响[D].新疆师范大学,植物学,2013,硕士.