1、基因工程蛋白hCD80/anti-CD19 scFv的中试及体外功能研究 2、去泛素化酶对NPM1c及AML1-ETO泛素化调节机制的初步探索

【摘要】本研究构建了原核表达载体pET32a-hCD80/anti-CD19scFv,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中经IPTG诱导表达了基因工程蛋白hCD80/anti-CD19scFv(双功能蛋白抗CD19/B7)。所表达蛋白为N端含有Histag和TrxTagTM标签的可溶性蛋白,产量较前期研究的表达系统显著提高。初步纯化产物经过肠激酶切除其N端的Histag标签和TrxTagTM融合蛋白序列,经二次纯化后,得到不带Histag的hCD80/anti-CD19基因工程蛋白。ELISA实验表明工程蛋白保留了其特异性的CD19抗原结合活性。体外功能实验表明,CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的原代肿瘤细胞,在体外经双功能蛋白抗CD19/B7修饰后,可诱导化疗缓解后的自体淋巴细胞活化,继而特异性杀伤自体肿瘤细胞。本研究进一步通过高密度发酵获得了大量可溶性基因工程蛋白,采用125Ⅰ标记法研究了双功能蛋白抗CD19/B7在KM小鼠体内代谢及组织分布。结果表明,经尾静脉给药,双功能蛋白抗CD19/B7在KM小鼠体内药代动力学行为符合二室模型,组织分布时间为19.2±10min,血浆消除相半衰期为11.6±0.7h。双功能蛋白抗CD19/B7在小鼠的肝、脾、肺、肾等组织分布浓度较高,主要通过肾脏代谢。本中试实验为进一步研究奠定了基础。多种白血病相关蛋白及造血相关调节因子受泛素-蛋白酶体途径的调节(ubiquitin-proteasomepathway),或通过调节该途径的功能参与细胞生物学调控。探索白血病或造血相关因子在蛋白内的泛素化修饰与稳定性,研究其影响因素,不仅可以进一步阐明造血系统疾病的发生机制,还可探寻新的疾病治疗靶点。已有研究报道NPM1及AML1-ETO均可被泛素化修饰,通过泛素-蛋白酶体途径发生降解,目前尚无逆向调节这些分子泛素水平的相关去泛素化酶(DeubiquitinatingEnzymes,DUBs)报道。为此,本研究应用双荧光报告系统偶联shRNA干扰技术,探索去泛素化酶家族基因对NPM1cA(胞浆型NPM1突变体A)及AML1-ETO的调节作用。本研究构建了新的pCMV-DsRed-IRES-EGF-MCS双荧光报告载体,并将NPM1、NPM1cA及AML1-ETO开放读码框序列克隆到该报告载体MCS多克隆酶切位点。我们通过上述三种报告载体,在293T细胞中分别表达了这三种蛋白,观察了它们的在293T细胞中的定位；应用流式细胞仪检测手段检测到三种蛋白在293T细胞的高稳定性,且定位于核仁的野生型NPM1比定位与胞浆的NPM1c稳定。综上,本研究初步建立了双荧光报告系统偶联shRNA干扰技术平台,初步探索了去泛素化酶家族基因对NPM1cA及AML1-ETO的调节作用,表明该检测体系和筛选方法有效可行。
【作者】陈礼平；
【导师】王建祥；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2010，博士
【关键词】scFv；AML1-ETO；NPM1c；泛素化；功能蛋白；报告载体；中试实验；细胞毒作用；原核表达载体；中国医学科学院；

【参考文献】
[1]胡广峰.钢铁企业产品质量管理信息系统的研究与开发[D].山东科技大学,2005.
[2]张军.介入治疗对急性冠脉综合征患者近期疗效的观察[D].山西医科大学,心血管内科,2003,硕士.
[3]王星.中美广告伦理表达比较研究[D].上海外国语大学,传播学,2013,硕士.
[4]张建发.基于GIS的物流配送选址规划研究[D].湖南科技大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[5]李云.特征选择算法及其在基于内容图像检索中的应用研究[D].重庆大学,2005.
[6]梁智文.我国公益性文化事业发展研究[D].郑州大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[7]刘丹.金属氧化物协同掺杂对钛酸钡陶瓷铁电性能的影响[D].陕西科技大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[8]段家铁.含氧原子氢键受体吸附树脂的合成及吸附性能[D].湖南师范大学,有机化学,2003,硕士.
[9]罗丞.我国国家研究与实验平台建设的经济学分析[D].武汉理工大学,产业经济学,2003,硕士.
[10]崔娜.从文盲到识字人：1949-1959年内蒙古地区扫盲运动研究[D].内蒙古大学,中国近现代史,2014,硕士.
[11]李现国,苗长云,符祎,杨彦利,仲为亮.矿用输送带接头伸长量计算及故障检测方法[J].煤炭科学技术.
[12]苏美先.空气净化器的研究和设计[D].广东工业大学,工业设计工程（专业学位）,2014,硕士.
[13]余君.热点网络舆情生成及传播模式分析研究[D].中南民族大学,传播学,2013,硕士.
[14]龙群梅.深化税制改革研究[D].湖南农业大学,农业经济管理,2003,硕士.
[15]吴佩烔.基于HSK作文语料库的外国学生汉语比喻运用研究[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[16]孙梦婕.菲利普·崔西（Philip Treacy）帽饰设计研究[D].苏州大学,设计艺术学,2013,硕士.
[17]于娟娟.新型LiMPO_4（M=Fe，Mn）和SnO_2纳米材料的合成与性能研究[D].中南民族大学,物理化学,2013,硕士.
[18]邹艳辉.基于MCMC的广义Gamma混合模型的参数估计及其应用[D].西南交通大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[19]王永青.TGF-α Ki-67与脑膜瘤良恶性及侵袭性的相关研究[D].浙江大学,外科学,2004,硕士.
[20]柯远.摇滚的美学：中国大陆摇滚音乐研究[D].西南大学,美学,2013,硕士.
[21]孙连超.面向用户的出行前城市停车选择模型研究[D].重庆交通大学,载运工具运用工程,2012,硕士.
[22]陈文骏.无刷直流电动机控制系统的研究[D].华东交通大学,电气工程（专业学位）,2013,硕士.
[23]李刚.论媒体监督与司法公正[D].中国社会科学院研究生院,传媒与信息法（专业学位）,2014,硕士.
[24]柯荔.基于改进LHD和SVR参数优化方法的产品结构优化设计[D].华中科技大学,工业工程,2013,硕士.
[25]梁桥欣.特长公路隧道空间交叉结构及地下洞群施工力学特征研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[26]张洁,李灵锋,郭大鹏,张媛,王琦,李鹏,汪小知.芯片级高场非对称波形离子迁移谱技术检测危险品[J].分析化学,2013,07:986-992.
[27]傅川.山东省胶东地区引黄调水工程综合通信系统[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[28]傅海燕.Reflective Teaching:a Journey in Pursuit of Professional Development of English Teachers[D].杭州师范大学,课程与教学论,2007,硕士.
[29]丁春光.基于CPFR的协同预测模型及其系统构建研究[D].东北大学,管理科学与工程,2010,硕士.
[30]陈敏.进城务工人员随迁子女义务教育权利保障问题研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[31]胡淼.预付式消费法律问题研究[D].吉林财经大学,经济法学,2014,硕士.
[32]李锦堂.影响岩土热物性参数测试的分析及地埋管换热器传热模型的研究[D].重庆大学,动力工程及工程热物理,2014,硕士.
[33]李云辉.一般纳税人增值税流失率的实证研究[D].云南财经大学,税务（专业学位）,2014,硕士.
[34]蔡忠云.集装箱船参数化有限元分析模块的研究与应用[D].武汉理工大学,工程力学,2004,硕士.
[35]刘冬.对主体模式下高中生历史观教育的探讨[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[36]韩冬.银保通业务系统的分析与设计[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[37]邢彤,左强,杨永帅,阮健.液压激振技术的研究进展[J].中国机械工程,2012,03:362-367+377.
[38]朱斌斌.南水北调外迁移民幸福感研究[D].湖北工业大学,政治学理论,2014,硕士.
[39]陈爱国.焦作市行政审批改革研究[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[40]蓝汉林,郑春晔.浙江独立学院产生的条件、机制与模式分析——基于历史制度主义的分析视角[J].中国高教研究,2014,06:62-67.
[41]廖宁,李亚伟,桑绍柏.浸入式水口渣线用锆碳材料研究现状[A].中国金属学会连续铸钢分会.2013年连铸新技术及关键耐材长寿化学术研讨会论文集[C].中国金属学会连续铸钢分会:,2013:7.
[42]司建超.四氧化铁磁性纳米棒的合成、修饰及其在锂离子电池中应用[D].西北大学,物理化学,2014,硕士.
[43]徐梅,梅世强.经济波动谱分析方法的比较研究[J].控制与决策,2003,03:351-354.
[44]王少培.基于有限元的分子结构力学方法对石墨烯力学性能研究[D].天津大学,2012.
[45]王敏.基于Hirota方法的变系数非线性发展方程孤子解的研究[D].北方工业大学,应用数学,2013,硕士.
[46]陈运涛.关于客户关系管理系统的实现[J].中国质量,2002,08:8-11.
[47]邱知文.QinQ环境下802.1x认证在校园宿舍网中的部署实现与应用[D].复旦大学,计算机技术,2012,硕士.
[48]罗博文.基于光学环镜的超宽带脉冲处理技术研究[D].华中科技大学,光学工程,2013,硕士.
[49]刘震新.银行业监管绩效评价问题研究[D].兰州大学,公共管理,2012,硕士.
[50]余琼瑶.脂溶性茶多酚对火麻仁油部分生物活性的影响[D].浙江大学,茶学,2012,硕士.