第一部分 DLK1基因在骨髓增生异常综合征发生中的作用机理研究 第二部分 MLF1IP基因在真性红细胞增多症发生中作用机制的初步研究

【摘要】Delta-like-1(DLKl)基因编码一种跨膜蛋白,属于表皮生长因子样蛋白家族。该基因是一种印记基因(imprintedgene),广泛表达于从鸟类到人类的动物中,在一系列胎儿组织及特定成体器官如肾上腺及胎盘等中均有表达。已有研究发现骨髓增生异常综合征(MDS)患者高表达DLK1基因,提示DLK1可能与MDS发生、演进相关。为了进一步研究DLK1基因在MDS发生中的作用机制,本研究首先采用realtimePCR检测了髓系肿瘤患者骨髓单个核细胞DLK1基因mRNA表达水平,并通过在小鼠髓系祖细胞系32D细胞中过表达该基因后细胞增殖、分化和凋亡等细胞生物学特征研究,以及过表达该基因3T3细胞系细胞体外集落培养和在裸鼠体内成瘤的影响,以期探索DLK1在MDS发生中的作用。主要研究结果有：1、采用realtimePCR检测了57例初发急性髓系白血病(AML)、69例骨髓增生异常综合征(MDS)和78例骨髓增殖性肿瘤(MPNs)患者中DLK1基因mRNA的表达。结果证实了DLK1在MDS患者中高表达,MPN患者次之,二者DLK1表达水平均显著高于正常人对照(p<0.05),AML患者中DLK1水平最低,且显著低于正常人对照(p<0.05)。2、过表达DLK1的小鼠髓系祖细胞系32D细胞体外增殖实验结果发现DLK1过表达抑制细胞的增殖。流式细胞术分析细胞周期检测结果表明细胞增殖抑制与DLK1过表达后细胞阻滞于G2+M期有关。3、G-CSF诱导过表达DLK1的小鼠髓系祖细胞细胞系32D细胞向粒系分化实验发现,尽管32D-DLK1细胞及对照组32D-GFP细胞均可向粒系分化,但DLK1过表达使32D细胞向粒系分化的细胞程度相对于对照组减低(p<0.05),即DLK1过表达有抑制32D细胞向粒系分化的作用。4、低血清培养诱导过表达DLK1的小鼠髓系祖细胞细胞系32D细胞凋亡实验结果表明32D-DLK1细胞及对照组32D-GFP细胞均发生凋亡,但32D-DLK1细胞在低血清培养条件下凋亡细胞比例较对照组高(p<0.05),即DLK1过表达具有促进细胞凋亡的功能。5、过表达DLK1基因的3T3细胞系细胞裸鼠成瘤实验发现3T3-DLK1细胞在裸鼠皮下形成的瘤块显著小于对照组细胞所形成的瘤块,提示DLK1过表达能够抑制3T3细胞在裸鼠皮下成瘤。综上,本研究首先再次证实了MDS患者高表达DLKl。过表达DLK1的小鼠髓系祖细胞系32D细胞和3T3细胞系生物特征研究表明,过表达DLK1可抑制32D细胞增殖、阻滞细胞分化、诱导细胞凋亡及影响3T3细胞的成瘤性,DLK1基因可能通过这些机制参与了MDS的发生和演进。MLFIIP基因位于染色体4q35.1,由14个外显子组成,其基因组DNA全长75.8kb。cDNA编码一46-kDa的蛋白。已有研究证实在造血系统中,MLF1IP主要表达于红系,并只表达于CFU-E阶段。真性红细胞增多症(polycythemiavera,PV)是一种红细胞不受控制的增殖为特征的造血干细胞疾病。我们推测MLFIP基因可能参与了PV的发生。为了验证我们的假设,首先采用绝对定量PCR法检测了髓系肿瘤患者骨髓单个核细胞MLF1IP的表达水平,发现PV患者高表达MLF1IP.为了进一步探讨其可能的作用机制,通过RNA干扰下调红白血病细胞系k562细胞MLF1IP的表达水平,对该蛋白表达水平下调后k562细胞生物学特性的变化进行了研究。本研究主要结果有：1、采用绝对定量PCR的方法,检测89例MDS患者、55例MPN患者、44例AML患者和13例正常人骨髓单个核细胞MLF1IP的表达,结果表明MLF1IP高表达于MPN患者,尤其是PV患者中,PV患者MLF1IPmRNA水平平均值为0.04,显著高于正常人对照组的0.007。(p<0.05)。2、应用MLF1IPshRNA载体干扰下调k562细胞系中MLF1IP的表达,集落形成实验表明MLF1IP水平降低后,k562所形成的集落数较对照组明显降低,K562细胞集落数由由对照处理组的(318.0±35.68)／孔降至(154.0±46.13)／孔(P<0.05)。3、应用MLF1IPshRNA载体干扰下调k562细胞系中MLF1IP的表达后,瑞士染色检测其分化程度,结果表明MLF1IP水平下降不能改变k562细胞的细胞形态。4、应用MLF1IPshRNA载体干扰下调k562细胞系中MLF1IP的表达后,结果发现MLF1IP水平降低能显著促进VP16诱导的k562细胞的凋亡。与VP16单独处理组相比,联合MLF1IP干扰和使用VP16时,k562细胞凋亡率由(32.99±4.919)%升高到(46.50±2.374)%%(P<0.05)综上,我们首次证实了PV患者异常高表达MLF1IP基因,通过RNA干扰下调红白血病细胞系k562细胞MLF1IP的表达水平,对该蛋白表达水平下调后k562细胞生物学特性的变化的初步研究表明,MLF1IP基因可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等机制参与了PV的发生。
【作者】马晓瑭；
【导师】肖志坚；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2011，博士
【关键词】骨髓增生异常综合征；DLK1基因；发病机制；增殖；分化；凋亡；致瘤性；真性红细胞增多症；MLF1IP；

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