人卵巢癌细胞系不同侵袭能力细胞亚群的分选及其生物和遗传学特点分析

【摘要】研究背景卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤。目前研究认为肿瘤异质性是导致患者肿瘤耐药,治疗失败的主要原因。肿瘤在不断发生着异质性变化,用不变的治疗模式去治疗不断变化的肿瘤,显然不能达到彻底治愈的效果。卵巢癌也是一种异质性疾病,每一个卵巢肿瘤都可以被看成是许多遗传和表观遗传性状各异的细胞的集合。了解卵巢不同异质性亚群与肿瘤转移、复发及预后相关的分子表型和基因图谱特征,制定出有针对性的个体化治疗方案,对肿瘤的长期控制产生极其重要的促进意义。研究目的1从人卵巢浆乳癌细胞系A2780和SKOV3中分别分离和筛选出具有不同侵袭、迁移能力的单细胞亚群；2对筛选出的高、低侵袭单细胞亚群进一步进行转移相关表型特征的检测和验证,以明确其能否作为卵巢癌异质性相关机制研究的细胞模型模型；3对2组高、低侵袭单细胞亚群,进行全基因组外显子测序(ExomeSeq)分析和转录组测序(RNASeq),筛选出可能与卵巢癌不同侵袭能力等肿瘤异质性产生相关的候选基因,为下一步的临床验证打下基础。研究方法1通过有限稀释法,对2个卵巢浆乳癌细胞系A2780、SKOV3进行单细胞分选和克隆化培养。Transwell小室体外侵袭和迁移实验+MTT法对分选出的单细胞亚群的侵袭、迁移能力进行初步的鉴定。根据实验结果筛选出侵袭能力最强和最弱,并且性状相对稳定的单细胞亚群。2利用MTT法和流式细胞术检测比较高、低侵袭单细胞亚群细胞增殖能力的差异；PI和AnnexinV双标记流式细胞仪检测、比较二者的细胞凋亡率,然后通过RealTimePCR和WesternBlot检测检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase3及Caspase7mRNA和蛋白水平,比较高、低侵袭单细胞亚群抗凋亡能力的差异；通过检测抗失巢凋亡蛋白TrkB和自噬活性相关蛋白Beclin1mRNA和蛋白表达水平,比较二者的抗失巢凋亡能力和自噬活性的差异；MTT法检测二者对紫杉醇和顺铂的药物敏感性；裸鼠皮下注射肿瘤细胞,比较二者成瘤能力的差异；3利用G显带技术对高、低侵袭亚群进行染色体核型分析,比较二者在染色体水平的异质性,并对各个单细胞亚群内部的均质性进行评价；对高、低侵袭单细胞亚群进行ExomeSeq和RNASeq。比较高、低侵袭亚群基因图谱的差异,筛选出可能与卵巢癌不同侵袭能力等肿瘤异质性产生相关的候选基因,为将来的临床验证打下基础。研究结果1.通过有限稀释法,在常规细胞培养条件下,分别从卵巢浆乳癌细胞系A2780及SKOV3经单细胞分离和克隆化培养,得到45个和40个单细胞亚群。经外侵袭、迁移能力实验的鉴定、筛选,得到侵袭、迁移能力差异最大,且性状相对稳定的单细胞亚群,分别命名为A-H,S-H,以及A-L,S-L。筛选出的单细胞亚群经连续传代至30代左右,性状仍保持相对稳定。2.A-H和A-L,S-H和S-L,不但在体外侵袭、迁移能力方面,在细胞增殖、抗凋亡及失巢凋亡、自噬活性、抗药性,以及裸鼠异体移植成瘤能力等多个转移相关的表型特征方面,均具有显著的异质性,高侵袭单细胞亚群表现出更强的独立存活能力。3.A-H和A-L,S-H和S-L,在染色体水平上也具有明显的异质性,而4个单细胞亚群内部则表现出良好的均质性。ExomeSeq数据经逐步筛选和过滤,最终在2组高、低侵袭亚群之间获得共同差异基因变异位点共计66个(包括Indel：57个,SNP：9个)。在其中随机选择10个位点进行了Sanger测序验证,发现CNTNAP1在2个高侵袭单细胞亚群存在5’-UTR区的突变,而在2个低侵袭亚群则为阴性。RNASeq,按照P<0.05,Foldchange>2的标准,在2组高、低侵袭单细胞亚群之间筛选到差异基因25个(包括20个基因在A-H及S-H转录本中同时上调,5个在A-L及S-L中同时上调)。选择部分候选基因经RealTimePCR验证,发现PI3K/AKT/mTOR信号传导通路中,PIK3CA、PIK3CA、AKT3、ECM1、GPCR等基因的mRtNA在A-H及S-H中均显著增高,肿瘤抑制基因Nur77,PTEN显著降低。MTOR通路中,mTOR及PRKCB基因的mRNA在A-H、S-H中亦显著增高。结果与RNASeq结果一致。WesternBlot结果在蛋白水平再次说明了RNASeq结果可信。研究结论1人卵巢浆乳癌细胞系中存在着具有不同侵袭能力的异质性细胞亚群。2A-H/S-H与A-L/S-L是较为理想的研究卵巢癌肿瘤内异质性的细胞模型。3高侵袭细胞亚群具有更强的独立存活能力,可能在肿瘤的浸润,转移和耐药过程中发挥着更主要的作用。4CNTNAP1基因突变,PI3K/AKT/mTOR信号传导通路激活及其相关基因的异常表达可能与卵巢癌不同侵袭能力等肿瘤内异质性的产生相关。但有关其作用机制和临床意义有待进一步的研究和验证。
【作者】白会敏；
【导师】沈铿；
【作者基本信息】北京协和医学院，妇产科学，2014，博士
【关键词】卵巢癌；肿瘤异质性；细胞亚克隆；侵袭；外显子测序；转录组测序本课题总的实验设计流程见下图；

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