文昌鱼microRNA及其合成代谢相关蛋白的识别、鉴定及比较基因组分析

【摘要】文昌鱼是现存与脊椎动物亲缘关系较近的物种,被誉为研究脊椎动物起源和进化的“活化石”。microRNA(简称miRNA)是一类与转录后基因沉默相关的长度为21-25nt内源性的非编码小RNA,在精细调控基因表达及生物生长发育方面发挥着重要作用。目前,文昌鱼miRNA研究仍处于初级阶段,数据库中报道的文昌鱼miRNA数量仍然有限。因此,本论文进一步利用生物信息学方法系统开展了文昌鱼miRNA及其合成代谢相关蛋白的识别、鉴定与比较基因组学研究,得到以下重要的研究结果：1.利用生物信息学技术及RNAfold软件和Triplet-SVM算法,对佛罗里达文昌鱼基因组中新的miRNA进行鉴定,最终获得了245个佛罗里达文昌鱼miRNA,其中183个miRNA为新鉴定的基因。基因组定位分析发现,scaffold211上连续分布了9个成簇存在的miRNA,EST表达分析暗示着这些miRNA是表达的。物种间同源miRNA比较发现,相比较于其他无脊椎动物,文昌鱼与脊椎动物具有更高的同源性。对预测的52个佛罗里达文昌鱼miRNA家族比较发现,这些保守的miRNA家族分布具有物种／家族特异性。比较不同物种间miRNA家族类型和拷贝数,发现文昌鱼miRNA家族经历了一个基因扩增的转变阶段,且发现无脊椎动物中miRNA家族多以单拷贝的形式存在。对佛罗里达文昌鱼不同发育阶段miRNA表达谱分析,发现仅有19个miRNA在佛罗里达文昌鱼发育阶段广泛表达,绝大多数miRNA具有发育阶段表达特异性。文昌鱼miRNA靶基因鉴定及功能注释,发现miRNA靶基因功能主要涉及细胞粘着分子活性、分子伴侣、防御或免疫蛋白活性、催化及酶调节活性等。另外,预测的靶基因中发现有79个基因为之前文章中报道的免疫相关基因,推测佛罗里达文昌鱼部分miRNA可能与文昌鱼的免疫作用有关。2.利用生物信息学方法从白氏文昌鱼(Branchiostomabelcheri)Solexa高通量测序数据中鉴定miRNA基因,总计获得了483个白氏文昌鱼miRNA,其中287个为新鉴定的白氏文昌鱼miRNA。进一步鉴定miRNA的前体序列,总计获得了238个miRNA前体序列。基因组定位分析发现,304个miRNA匹配86个scaffold,每个scaffold上分布的miRNA的数目从1-25不等,scaffold22连续分布了25个成簇的miRNA.11个miRNA能匹配基因组多个位置,存在多拷贝的现象,暗示着基因组重复事件的发生。保守性分析结果显示,58.39%预测的白氏文昌鱼miRNA能横跨1-89个物种间保守(E值≤10-5),白氏文昌鱼miRNA与已知的121个(64.71%)佛罗里达文昌鱼miRNA高度相似。预测的白氏文昌鱼miRNA可以分为70个家族,其中99%白氏文昌鱼miRNA家族在佛罗里达文昌鱼中保守。70个白氏文昌鱼miRNA家族具有物种／家族特异性,其中有39个(55.71%)miRNA家族属于文昌鱼属特有,这些物种特异性的miRNA家族的存在对于进化的独特性将起到一定的作用。比较不同物种间miRNA家族类型和拷贝数,发现不同的物种miRNA家族类型和拷贝数存在差异,miRNA基因数量随着生物个体复杂性的增加,在基因组进化过程中呈现不断扩张的趋势。对不同物种中miRNA前体序列中重复序列分析结果显示,相对于人和海鞘,文昌鱼miRNA前体序列中分布重复序列较少,暗示着重复元件对文昌鱼miRNA在进化过程中的扩增并未产生多大的影响。3.利用同源搜索及生物信息学方法在文昌鱼、海鞘、七鳃鳗及紫海胆的基因组中搜索参与miRNA合成代谢相关蛋白。利用最新版本GENSCAN和GeneWise软件预测基因结构,进一步拼接出基因的全长或部分cDNA序列。通过RT-PCR实验及EST表达分析进一步验证了预测的可靠性。保守结构域分析结果显示,同一基因家族的大部分蛋白具有相同或相似的结构域,在文昌鱼和小鼠Drosha蛋白中预测出两个独特的结构域YppG和Drf_FH1结构域。不同物种间蛋白基因的同源性比较发现,相对于海鞘,文昌鱼与脊椎动物中各蛋白具有较高的相似性。EST表达分析显示佛罗里达文昌鱼和玻璃海鞘中的各蛋白基因具有发育阶段表达特异性。使用MEME软件预测蛋白基序,结果获得了Drosha和Dicer蛋白5个高保守的基序,AGO和Piwi蛋白10个保守的基序,AGO蛋白的基序中包含了一个三联体的催化位点‘’D-D/G-H/R”,Piwi蛋白中包含‘’D-D-H/K/R’’催化位点。基因结构比较发现,脊椎动物与无脊椎动物之间各蛋白家族基因外显子数目之间存在差异,哺乳动物Drosha蛋白一般含有30个外显子,而昆虫只有3-11个外显子,文昌鱼与脊椎动物之间基因结构较相似。通过比较各蛋白基因平均外显子和内含子长度发现,昆虫和线虫Drosha和Dicer蛋白基因平均外显子的长度要大于平均内含子的长度,但人、斑马鱼等物种却相反,文昌鱼和海鞘与脊椎动物基因结构相似。系统进化分析结果显示,所有的Piwi蛋白可以分为两个簇,其中一个簇包含人的PIWIL1、PIWIL3和PIWIL4及相关的同源基因,另一个簇包含人PIWIL2及相关的同源基因。进化压力分析结果显示,Dicer基因中存在着大量的正选择位点,这些正选择位点的存在对Dicer基因的结构和功能的变化起到了非常关键的作用。以上的研究结果为更深入理解文昌鱼miRNA及其合成代谢相关蛋白的功能、揭示文昌鱼自身的生命活动规律以及揭示脊椎动物起源和演化机制提供了重要的理论基础,对更进一步研究文昌鱼功能基因组学具有重要的理论意义和实践价值。
【作者】周学；
【导师】马飞；
【作者基本信息】南京师范大学，动物学，2014，博士
【关键词】文昌鱼；microRNA；合成代谢相关蛋白；进化；比较基因组学；

【参考文献】
[1]庄春华.基于Big6模式的小学语文主题探究学习的设计研究[D].渤海大学,教育技术学,2014,硕士.
[2]张洪.别让客户关系管理成为你的滑铁卢[J].中国中小企业,2002,12:30-31.
[3]柴丽雅.钴基还原态氧化石墨复合材料制备及NO_x气敏性研究[D].黑龙江大学,物理化学,2013,硕士.
[4]陈毓川.解析矿产资源[J].科学中国人,2014,01:28-33.
[5]丁锋,谢新民,方崇智.时变系统辨识的多新息方法[J].自动化学报,1996,01:85-91.
[6]黄妍妍.中国民间年画的包装设计研究[D].湖南工业大学,设计艺术学,2012,硕士.
[7]蔡立群.几种保护性耕作措施效应的初步研究[D].甘肃农业大学,作物栽培学与耕作学,2003,硕士.
[8]钟琳.我国银行卡消费者权益保护研究[D].上海交通大学,公共管理,2013,硕士.
[9]王波.2012年欧洲杯决赛阶段西班牙队在比赛中进攻战术特征研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[10]葛汝刚,黄小原.参数不确定的供应链传递函数H_∞保成本计算与分析[J].控制与决策,2009,06:874-878.
[11]付红丹.城镇化进程与产业结构协调发展研究[D].河北经贸大学,国民经济学,2012,硕士.
[12]徐莹莹.LTE系统上行链路调度算法研究[D].北京交通大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[13]时琦昊.盆式绝缘子环氧浇注模用脱模机研究[D].长安大学,机械电子工程,2013,硕士.
[14]励肇华.关于公安信息化建设的系统思考[J].上海公安高等专科学校学报,2002,06:39-42.
[15]王毅.CCOS技术中磨头工作函数优化设计及工件去除量函数曲线的模拟[D].苏州大学,光学,2003,硕士.
[16]王晓晔.时间序列数据挖掘中相似性和趋势预测的研究[D].天津大学,2003.
[17]丁元.生态城镇建设问题研究[D].中共吉林省委党校,政治经济学,2013,硕士.
[18]叶伟伟.蓼属神血宁组花被片微形态及多穗蓼系统位置研究[D].曲阜师范大学,植物学,2013,硕士.
[19]梁鑫.DQ辽宁市场营销策略研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[20]魏夏.我国乡镇政府公务员绩效管理现状及对策研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[21]王威.我国新媒体艺术的流变与未来展望的思考[D].吉林大学,设计艺术学,2013,硕士.
[22]张俊禹.基于风险测度的万合客车技术改造项目投资收益研究[D].哈尔滨工业大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[23]陈必强.脂肪酶固定化及其在化学品合成中的应用[D].北京化工大学,生物化工,2008,博士.
[24]杨露.环境公益诉讼司法模式的构建[D].重庆大学,环境与资源保护法学,2014,硕士.
[25]安泰淑.基于2002世界杯旅游接待设施状况的赛事后管理研究分析[D].浙江大学,旅游管理,2003,硕士.
[26]陈祖毅.药物缓释微球动脉化疗栓塞术与传统的碘化油动脉化疗栓塞术治疗原发性肝癌的Meta分析[D].广西医科大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[27]冯颖,胡跃明,苏春翌.基于Prandtl-Ishlinskii模型的一类回滞非线性系统自适应控制[J].自动化学报,2006,03:450-455.
[28]张建霞.社区H型高血压患者的焦虑、抑郁状况与相关因素研究[D].山西医科大学,护理学,2013,硕士.
[29]张玮娜.2-12岁汉语儿童情绪词使用情况的研究[D].辽宁师范大学,基础心理学,2011,硕士.
[30]程玲.高龄高血压患者24小时血压值与腔隙性脑梗死和脑白质病变的关系[D].中国人民解放军医学院,神经病学,2013,硕士.
[31]李明.两种纳米晶Nd-Fe-B磁体的高温热变形研究[D].宁波大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[32]刘坡.李梦阳与明代诗坛研究[D].上海师范大学,中国古代文学,2012,博士.
[33]黄少锋,吴麟琳.基于电气量频率差异的电力系统振荡识别[J].电力系统自动化,2012,23:18-22.
[34]徐建委.两汉教化故事的流通和《五经》理念的伦理化[D].中国社会科学院研究生院,中国古代文学,2003,硕士.
[35]孙时磊.新生血管性青光眼患者血清及房水中PEDF、VEGF水平及其病因相关性研究[D].大连医科大学,眼科学,2012,硕士.
[36]游果红.天润苑小区营销策略研究[D].大连理工大学,工商管理,2004,硕士.
[37]董莉.夹脊电针结合腰痛颗粒剂治疗腰椎间盘突出症的临床观察与实验研究[D].湖北中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[38]李佩章.建设30兆瓦太阳能电站的可行性研究[J].发电设备.1990(02)
[39]刘阳.数据仓库技术在《金匮》文献整理和研究中的应用初探[D].北京中医药大学,2003.
[40]樊建平.建筑企业ERP系统的分析、设计及物资管理子系统的开发[D].华北电力大学（北京）,管理科学与工程,2003,硕士.
[41]高君.职业女性工作压力与工作绩效的关系研究[D].云南财经大学,企业管理,2013,硕士.
[42]秦郑.基于绩效评价的高校绩效工资分配方案设计研究[D].西南交通大学,行政管理,2013,硕士.
[43]张龙姣,张阳德,申玉璞,申玉坤.PF127修饰的石墨烯复合材料的制备及其载药系统研究[J].生物学杂志,2014,03:60-64.
[44]孟晓萌.基于化学修饰电极对核酸检测的研究[D].山东农业大学,2013.
[45]王来.北京旅游产业发展研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[46]张新彦.全固态单偏振单模光子晶体光纤结构设计研究[D].苏州大学,光学工程,2013,硕士.
[47]柯瀚,郭城,陈云敏,凌道盛,潘易.考虑降解效应的城市固体废弃物非线性本构模型[J].岩土力学,2014,05:1217-1223.
[48]黎航.芙蓉区政府信访管理系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[49]王建璋.船舶融资租赁制度研究[D].大连海事大学,海商法,2014,硕士.
[50]苏良俊1,2,张斌2,陈仁尔2,叶余原2,沈健芬2,张泉2,周其忠2,3*,蒋华江.天然产物EchinoclathrinesA的全合成[J].浙江大学学报(理学版),2014,05:542-544.