补中益气丸干预气虚质的临床观察及其血浆代谢组学机制研究

【摘要】背景：中医体质是指人体生命过程中,在先天禀赋和后天获得的基础上所形成的形态结构、生理功能和心理状态方面综合的、相对稳定的固有特质；表现为结构、功能、代谢以及对外界刺激反应等方面的个体差异性,对某些病因和疾病的易感性,以及疾病传变转归中的某种倾向性。而气虚质则是以气短懒言,容易疲乏,精神不振,易出汗等为主要表现的体质类型。目前对气虚质的研究仍处于流行病学调查阶段,其基因、蛋白、代谢方面的机制研究并不多。根据本课题组前期对体质的研究结果发现：①广东地区健康人群以平和质居多(占81.3%),偏颇体质仅占18.7%；亚健康人群以偏颇体质居多(占64.0%),其中气虚质所占比例最大(占41%)。②对健康、亚健康人群的中医体质进行Logistic回归发现,平和质与健康呈正相关,与亚健康呈负相关,气虚质与亚健康呈正相关。③平和质的人,不容易出现亚健康、疾病；偏颇体质的人,更容易出现亚健康、疾病状态。由此我们推测,气虚质与健康状态有着密切的联系。健康人亦存在气虚质,且对健康气虚质人群进行研究排除了疾病对监测结果的干扰,因此,我们设计了对健康人气虚质进行中药干预的随机、对照研究,同时应用代谢组学进行气虚质代谢紊乱的机制研究。代谢组学(metabonomics)是通过组群指标分析,进行高通量检测和数据处理,研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化,特别是对内源代谢、遗传变异、环境变化乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响的学科。代谢组学是对新陈代谢过程中所有低分子量(<1kD)代谢产物进行定性和定量的研究,以反映生物体对外界刺激或基因修饰所发生的变化的学科。与转录组学、蛋白组学相比,代谢组学有自身的优点。首先,代谢组是最接近表型,最能反应表型变化的,基因表达的变化引起蛋白表达的变化,最终以代谢过程的变化发生效应。因此,代谢组学研究在了解事物本质变化中具有重要的作用,基因和蛋白表达的微小变化还会在代谢物上得到放大。而且代谢物的数量比基因和蛋白的数量少得多。因此,我们选择代谢组学对气虚质的代谢紊乱进行研究。本课题组对亚健康气虚质的代谢组学研究发现,其尿液中肌酸酐、组胺、葡萄糖、丙氨酸、鸟苷、三磷酸甘油酸、磷酸肌酸、马尿酸、组氨酸、甘油酸水平显著升高,这些代谢产物与三羧酸循环、糖酵解、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等多个能量代谢通路相关。由前期研究结果可见,长期繁重的工作和精神紧张导致机体气血亏虚,能量消耗加快,代谢产物增多,使人产生疲乏感,出现亚健康状态。而健康的气虚质人,其体内阴阳气血已经失调,更容易受外界环境等因素影响导致亚健康、疾病的发生。因此,我们推测,气虚质存在代谢紊乱,给予益气中药干预可以调整气虚质的这种代谢紊乱,预防亚健康、疾病的发生。补中益气丸出自《内外伤辨惑论》,是金元四大家之一的“补土派”代表李东垣的代表方,主治气虚发热、泄泻,气虚不能固摄血液、下陷等症状。现代药理学研究发现补中益气汤具有调节胃肠运动、影响消化液分泌、抗肿瘤、抗突变、调节免疫力、抑菌消炎等综合作用。因此,补中益气丸很适合调理以气短懒言,容易疲乏,精神不振,易出汗等为主要表现,并伴有脾胃消化不良等不适症状的气虚质人群。目的：1、明确补中益气丸干预健康气虚质人群的临床疗效,为应用中医药手段干预中医偏颇体质提供科学依据。2、探讨补中益气丸干预健康气虚质人群代谢紊乱的机制。方法：1、进行健康人气虚质中药干预的研究。应用中医体质量表、亚健康调查表、生活方式量表和体检报告进行健康与体质状况判断,再进行面谈并采用中医四诊合参方法,进一步筛选健康人单纯气虚质,并将其随机分为气虚质对照组和药物干预组,干预组应用补中益气丸干预1个月,对照组不进行干预。随访观察研究对象的主要疗效指标为气虚质转化分改变情况,次要疗效指标为其他体质转化分改变情况和亚健康量表评分和生活方式量表评分,通过统计分析主要及次要疗效指标,以明确应用中药调理气虚质的临床疗效,为应用中医药手段干预中医偏颇体质提供科学依据。2、进行平和质与气虚质的代谢组学研究。从论文第二章临床观察的人群中筛选出气虚质,并纳入平和质人群,清晨空腹抽血后提取血浆-20℃冻存。血浆进行代谢组学特征分析后,对其结果进行生物信息学分析,建立代谢组差异代谢图谱库。3、进行补中益气丸干预气虚质的代谢组学研究。从论文第二章临床观察的人群中筛选出气虚质人群,对其用药前后干预组与对照组人群,清晨空腹抽血后提取血浆-20℃冻存。血浆进行代谢组学特征分析后,对其结果进行生物信息学分析,建立代谢组差异代谢图谱库。4、汇总代谢组学数据进行分析,采用MestReNova5.3软件进行代谢图谱预处理,对各分段积分值进行归一化处理。所得数据输出并转换到Excel格式并导入软件Simca-P12.0.1.0(UmetricsAB,Sweden)中进行多元统计分析。采用主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)和偏最小二乘法判别法(Partialleast-squaresdiscriminantanalysis,PLS-DA)进行分析,为强化组间差异,进一步采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。分析结果以得分图(Scoresplot)的形式表示。统计分析软件采用SPSS13.0。对血浆中的几种代谢物的归一化积分值(X±S表示)做统计学处理(两独立样本t检验)。在PLS-DA模型中提取VIP值(variableimportanceinprojection,VIP),选取VIP值>1的化学位移值,进一步对这些化学位移值的归一化积分进行统计学分析,提取P<0.05的化学位移值进行差异代谢产物成分鉴定。通过人类代谢产物数据库(http://www.hmdb.ca)及查阅文献来鉴定其代谢产物名称,初步探讨补中益气丸干预气虚质代谢紊乱的机制。结果：1、补中益气丸干预气虚质的临床观察研究通过初步调查、面谈筛选出愿意入组的健康气虚质研究对象74例,其中6例在研究过程中退出,最后完成观察共68例(对照组和干预组各34例)。分析结果：①用药前,气虚质对照组与干预组之间的主要评价指标和次要评价指标均无统计学差异(P>0.05)。②干预1个月后,主要评价指标即气虚质转化分,干预组有所下降(分数越高气虚质症状越明显),其用药前后的差异有统计学意义(t=4.355,P=0.000),而对照组在观察1个月后气虚质转化分较观察前差异无统计学意义(t=-1.145,P=0.26)。干预1个月后,对照组与干预组之间气虚质转化分差异有统计学意义(t=2.053,P=0.044)。③在次要评价指标中,干预1个月后,干预组用药前后中医体质量表中其他体质分数的变化无统计学意义(P>0.05)；而对照组在观察1个月后,其阳虚质、阴虚质、血瘀质分数较观察前有所升高(分数越高偏颇体质症状越明显),差异有统计学意义(P<0.05)。④干预1个月后,干预组生活方式评分有所升高(分数越高生活方式越健康),差异有统计学意义(t=-2.879,P=0.007)。而对照组分数变化无统计学意义(t=-1.366,P=0.181)。干预组与对照组亚健康评分无统计学差异(t=-0.811,P=0.421)。⑤在治疗前后气虚质量表各条目的比较中发现,干预组心慌、头晕、懒言症状分数有所下降,差异有统计学意义(P<0.05),对照组1个月后症状分数有所变化,但差异无统计学意义(P>0.05)。2、健康气虚质与健康平和质血浆1HNMR分析从论文第二章临床观察的气虚质人群中筛选出气虚质19人,并纳入平和质15人,采集清晨空腹血液样本进行代谢组学检测后,应用分析软件对图谱进行分析,采用PCA方法对气虚质与平和质样本建模,累计计算出6个主成分,模型参数R2X=0.856,Q2=0.504,模型分析了85.6%的原始数据。基于气虚质与平和质血浆代谢数据建立OPLS-DA模型,对两组样本建模,累计计算出2个主成分,模型参数R2X=0.531,R2Y=0.388,Q2=0.0787。可见气虚质与平和质之间可明确区分。气虚质组与平和质组血浆中对分类贡献较大的特异性代谢物11个,包括甜菜碱、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、烟酰胺核苷酸、异亮氨酸、门冬氨酸、肌醇。这些差异代谢物与脂肪酸代谢、三羧酸循环、鸟氨酸循环、氨基酸代谢、丙酮酸代谢、糖异生、丙氨酸循环、肌醇代谢、嘌呤嘧啶代谢、氨回收、神经递质传导、甘氨酸和丝氨酸代谢等多个代谢通路相关。3、补中益气丸干预组用药前后血浆代谢组学的研究从论文第二章临床观察的气虚质人群中筛选出气虚质20人(对照组和干预组各10人),采集干预组用药前、用药后和气虚质对照组志愿者血液(干预组有1人用药前标本因样本问题未能检测)进行代谢组学检测后,应用分析软件对图谱进行分析,采用PCA方法对干预组用药前后样本建模,累计计算出5个主成分,模型参数R2X=0.725,Q2X=0.382,模型分析了72.5%的原始数据。基于补中益气丸用药前后干预组的血浆代谢数据建立PLS-DA模型,对两组样本建模,累计计算出3个主成分,模型参数R2X=0.502,R2Y=0.967,Q2X=0.721。可见干预组在药物干预前后的样本可显著区分。干预组用药前后血浆中对分类贡献较大的特异性代谢物35个,包括肾固醇、辅酶A、谷固醇、醛固酮、缬氨酸、胆固醇硫酸盐、乙醇、前列腺素El、异亮氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甜菜碱、苯丙氨酸、苯丙醇胺、丙氨酸、甘油酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、α-亚麻酸、前列腺素D2、2-乙基丙烯酸、异维A酸、鞘氨醇、尿素、酪氨酸、’肾上腺素、乙酰氨基、甲基马尿酸、香草酸、马尿酸、N-乙酰基酪氨酸、羟基苯甲酸。多为糖、脂肪、蛋白质三大营养能量代谢过程的中间产物,与脂肪酸代谢、三羧酸循环、鸟氨酸循环、儿茶酚胺合成、氨基酸代谢、丙酮酸代谢、糖异生、类固醇合成、嘌呤嘧啶代谢、鞘脂类代谢、视黄醇的代谢、氨回收、磷脂合成代谢、甘氨酸和丝氨酸代谢、神经递质传导、线粒体电子传递链等多个代谢通路相关。结论：1、气虚质对照组观察1个月后发现其有向其他体质转化变成复合体质的倾向。2、气虚质可以通过补中益气丸进行改善和调理。3、应用补中益气丸干预气虚质后,其与三羧酸循环、氨合成相关的氨基酸、脂类、蛋白质有所降低,说明补中益气丸调节了气虚质的这种代谢紊乱。
【作者】毕建璐；
【导师】罗仁；
【作者基本信息】南方医科大学，中西医结合临床，2014，博士
【关键词】补中益气丸；健康人；气虚质；中医体质量表；代谢组；

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