丙泊酚对小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响

【摘要】胰岛素抵抗在危重病人中十分常见,严重影响危重病人的预后。丙泊酚可引起大鼠胰岛素抵抗,但具体机制尚不清楚。为了从分子水平探讨丙泊酚影响肝脏胰岛素抵抗的机制,本研究以正常培养的小鼠原代肝细胞及TNF-α诱导产生胰岛素抵抗的小鼠原代肝细胞为研究对象,检测丙泊酚对胰岛素信号通路关键酶磷酸化水平和细胞内糖原水平的影响,结果显示,丙泊酚可显著降低正常培养小鼠原代肝细胞Akt(Ser473)和GSK-3p(Ser9)的磷酸化水平,抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,抑制肝细胞糖原合成,从而引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗。对于TNF-α诱导产生胰岛素抵抗的小鼠原代肝细胞,丙泊酚预处理可缓解TNF-α对小鼠原代肝细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路及糖原合成的抑制,提示丙泊酚对TNF-α导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用。在大多数手术、创伤和危重病(如烧伤、脓毒血症)中胰岛素抵抗是常见的一种代谢紊乱,并伴有高血糖。在危重病人(特别是手术病人)中,高血糖伴随着死亡率上升、易感性增加、多发性神经病变、肾功能不全、输血需求增加、机械通气时间延长、入住ICU需求增加和住院时间延长。有研究表明,通过胰岛素强化治疗来严格控制血糖可降低创伤感染的风险并降低ICU病人的发病率和死亡率；虽然也有与之有争议的结果报道,但至少可以推测这些有争议的结果部分是由于胰岛素强化治疗所引发严重低血糖的机率增高所致。有研究发现,丙泊酚麻醉可引起大鼠显著的全身性胰岛素抵抗,在丙泊酚麻醉大鼠的骨骼肌和心肌组织中由胰岛素引起的葡萄糖摄取减少,肝糖输出增加,结果表明在肌肉中由胰岛素引起的葡萄糖摄取减弱及肝糖输出抑制受损与丙泊酚引起的全身性胰岛素抵抗有关。丙泊酚是目前最常用的静脉麻醉药,不仅用于各种手术的麻醉诱导和麻醉维持,而且还用于ICU病人的长时间镇静。丙泊酚在临床上广泛用于已知或未知患有胰岛素抵抗的病人,但是排除手术应激及脂溶性载体等因素,单独应用丙泊酚对胰岛素信号通路及胰岛素抵抗的影响尚无深入研究。丙泊酚是否会加重危重病人的胰岛素抵抗?发生胰岛素抵抗的危重病人输注丙泊酚是否安全?在本研究中,我们选取胰岛素作用的经典靶器官肝脏,同时也是调控糖脂代谢最重要的脏器,观察丙泊酚对小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响,探讨丙泊酚影响肝脏胰岛素抵抗的分子机制,为针对性地预防和治疗危重病人胰岛素抵抗提供更充分的科学依据,同时指导我们在临床麻醉工作中选择合适的麻醉方式和麻醉用药。第一章丙泊酚可引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗目的探讨丙泊酚对小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响。方法采用MTT法检测不同浓度丙泊酚培养条件下,小鼠原代肝细胞活力的变化。用终浓度为10μg/ml的丙泊酚处理小鼠原代肝细胞24h,Westernblot检测PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,蒽酮法检测糖原合成。用终浓度为10μg/ml的丙泊酚处理小鼠原代肝细胞24h,Westernblot检测PTEN蛋白含量,RT-PCR检测PTENmRNA表达。所有数据代表3次独立重复实验所得样本的均值。采用SPSS19.0统计学软件(SPSSInc.,Chicago,USA),计量资料以均数±标准差(斑s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用Tukey检验。方差不齐时采用Welch校正,多重比较采用Tamhane’sT2检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果在一定浓度范围内(1～25μg/ml丙泊酚对小鼠原代肝细胞活性无显著影响,但随着丙泊酚浓度增高,小鼠原代肝细胞活性逐渐下降。当丙泊酚终浓度达到100μg/ml时,小鼠原代肝细胞活性下降至对照组的35±5%(P=0.000)。在明确不同浓度丙泊酚对小鼠原代肝细胞活力的影响后,根据实验结果并结合临床及相关文献,选取10μg/ml丙泊酚终浓度,检测不同培养时间下丙泊酚对小鼠原代肝细胞活力的影响,结果显示培养32h后,小鼠原代肝细胞活力无显著变化(P=0.949,F=0.216)。丙泊酚处理后pAkt(Ser473)和pGSK-3β(Ser9)相对降低,糖原合成减少；用丙泊酚(终浓度10μg/m1)和LiCl(终浓度20μmol/L)处理小鼠原代肝细胞24h,Propofol+LiCl组与DMSO组相比较,两者在糖原合成上无显著差异(P=0.649),在pGSK-3β(Ser9)/GSK-3p上无显著差异(P=0.079),但在pAkt(Ser473)/Akt上两者差异有统计学意义(P=0.024)。丙泊酚处理后PTEN蛋白表达升高(P=0.001),PTENmRNA水平升高(P=0.026)。结论丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路。丙泊酚可引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗。GSK-3β(Ser9)磷酸化受到抑制是丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞糖原合成的关键环节。丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点在GSK-3β上游。丙泊酚从上游抑制了小鼠原代肝细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路。第二章PTEN基因沉默可逆转丙泊酚引起的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗目的探讨PTEN在丙泊酚所致小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗中所起的作用及所处的位置,为治疗丙泊酚的不良反应寻找可能的干预靶点。方法Cy3标记的siRNA转染小鼠原代肝细胞,用荧光显微镜观察其亚细胞分布定位。在小鼠原代肝细胞中转染公司合成的三段siRNA24h,设计并筛选得到有效干扰PTEN表达的siRNA片段。在小鼠原代肝细胞中同时加入丙泊酚(终浓度10gg/m1)和siR-996,培养24h,Westernblot检测PI3K/Akt/GSK-3p信号通路,蒽酮法检测糖原合成。所有数据代表3次独立重复实验所得样本的均值。采用SPSS19.0统计学软件(SPSSInc.,Chicago,USA),计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用Tukey检验。方差不齐时采用Welch校正,多重比较采用Tamhane’sT2检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果Cy3标记的siRNA转染10min后,在小鼠原代肝细胞中Cy3-siRNA的转染效率大于95%。与negativecontrol组比,siR-996能够最有效抑制PTEN表达,PTEN蛋白表达降低至对照组的51±5%(P=0.000),PTENmRNA水平降低至对照组的45+5%(P=0.000)。当PTEN基因沉默后,siR-996+Propofol组与NC+DMSO组相比较,两者在糖原合成上无显著差异(P=0.967),在pGSK-3β(Ser9)/GSK-3β上无显著差异(P=0.846),在pAkt(Ser473)/Akt上无显著差异(P0.757)。结论丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点可能在PTEN或其上游。第三章丙泊酚对TNF-α导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用目的观察丙泊酚对TNF-α导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响,探讨丙泊酚影响肝脏胰岛素抵抗的机制。方法用终浓度为10ng/ml的TNF-α处理小鼠原代肝细胞24h,Westernblot检测PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,蒽酮法检测糖原合成。用终浓度为10gg/ml的丙泊酚处理小鼠原代肝细胞6h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-a处理小鼠原代肝细胞24h,Westernblot检测PI3K/Akt/GSK-3p信号通路,蒽酮法检测糖原合成。所有数据代表3次独立重复实验所得样本的均值。采用SPSS19.0统计学软件(SPSSInc.,Chicago,USA),计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用Tukey检验。方差不齐时采用Welch校正,多重比较采用Tamhane’sT2检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果TNF-α处理24h后pAkt(Ser473)/Akt降低至对照组的45+12%(P=0.001),pGSK-3p(Ser9)/GSK-3(3降低至对照组的47±11%(P=0.001),糖原合成减少至对照组的49+10%(P=0.001)。用终浓度为10μg/ml的丙泊酚处理小鼠原代肝细胞6h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α处理小鼠原代肝细胞24h,Propofol+TNF-α组在PAkt(Ser473)/Akt、pGSK-3β(Ser9)/GSK-3β及糖原合成上均高于DMSO+TNF-α组(P=0.000;P=0.002；P=0.031)。结论用TNF-α处理小鼠原代肝细胞,可成功构建胰岛素抵抗的细胞模型。丙泊酚对TNF-α导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用,但这种保护作用并不是通过直接作用于PI3K-Akt信号通路实现的。全文结论1、丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗。2、GSK-3β(Ser9)磷酸化受到抑制是丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞糖原合成的关键环节,丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点在GSK-3β上游。3、丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点可能在PTEN或其上游。4、丙泊酚对TNF-α导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用,但这种保护作用并不是通过直接作用于PI3K-Akt信号通路实现的。
【作者】周龙；
【导师】徐世元；
【作者基本信息】南方医科大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】二异丙酚；胰岛素抵抗；小鼠原代肝细胞；蛋白激酶B；糖原合成酶激酶-3βRNA干扰；

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