CD19~+CD5~+CD1d~+B淋巴细胞与溃疡性结肠炎的相关性及黄芩苷的干预作用研究

【摘要】背景溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis,UC)是炎症性肠病(InflammatoryBowelDisease,IBD)的一种。该病病程长、易复发,与直结肠癌的发生密切相关。近年来,因本病就诊人数呈现逐步增加的趋势。尽管UC的发病机制尚没有明确,但其针对自身抗原的免疫反应在疾病的发展过程中起到重要作用。有越来越多的证据从不同侧面支持了本病自身免疫损伤学说。大量研究表明,Thl7/Treg、Thl/Th2转化失衡可能是IBD发病的重要因素之一。作为机体重要的免疫细胞,B细胞不仅可以介导体液免疫和细胞免疫发挥正性免疫调节作用,近年来的研究显示B细胞中存在具有负性调节作用的细胞亚群——调节性B淋巴细胞(RegulatoryBCell,Breg)。其主要功能是调节炎症过程,抑制过度炎症反应,是移植排斥、自身免疫病以及免疫功能紊乱等状态下的一种重要的保护性细胞,其作为一种新的炎症调节细胞有着广阔的应用前景。目前Breg的研究多集中在动物模型中,关于人类和非人灵长类动物体内Breg的研究仍较少见。而UC发病过程中是否存在效应性B细胞与调节性B细胞的转化失衡因素仍未知。有学者初步研究了小鼠体内的IL-10+Breg细胞对多种原因诱发的肠道炎症有良好的缓解作用。也有学者研究发现自身免疫病患者(如系统性红斑狼疮等)体内Breg调节功能的缺失。综合目前对Breg的研究可以发现,Breg具有多种表型。可谓是,疾病不同,表型不同；同一表型,不同疾病中的作用不同；刺激不同,Breg作用对象不同。其中与肠道及其炎症相关的是CD19+CD5+CD1d+B细胞群,本研究针对CD19+CD5+CD1d+B细胞,探讨其与UC发病的关系。Breg主要通过分泌IL-10发挥调节作用,而IL-10的分泌依赖TLRs/MyD88信号通路的作用。动物研究表明,LPS刺激小鼠脾细胞,能有效促进IL-10的分泌。作为LPS的配体,TLR4及其下游的MyD88信号与IL-10的表达有着密切关系。而LRs/MyD88介导的信号具有细胞特异性,如树突状细胞能通过该路径促进T细胞活化,而B细胞则通过提供一个富含IL-10的周围环境而抑制T细胞增殖和分化。同时,TLRs/MyD88/NF-KB信号通路是出发炎性反应的途径之一,黄芩苷能否特异性活化Breg的TLRs/MyD88通路,进而促进IL-10的表达有待探讨。目前,临床上治疗UC患者的一线药物不良反应明显,而顽固性、重症患者则要依赖毒副作用更严重的药物。因此,耐受性好的新的治疗途径亟待开发。UC属中医“痢疾”“肠癖”“肠风”“泄泻”“脏毒”等范畴。中药复方黄芩汤是传统医学治疗“泄泻”等病证的经典名方,中药黄芩的有效成分黄芩苷具有抗炎、镇痛、抗感染、抗过敏、抗氧化、肝纤维化、抗高血糖、抗肿瘤、抗细胞损伤、抗焦虑样效应等多重功效,临床应用广泛。现代药理学方法研究表明,黄芩苷的抗炎作用在于有效降低促炎因子IL-1β和TNF-α,并降低LPS活化的巨噬细胞内NF-κB的活性等。同时能抑制白细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成,抑制fMLP激发的白细胞内Ca2+升高,并促进细胞内cAMP水平提高,从而影响白细胞的多种功能。黄芩苷会否通过对Breg的调节发挥抗炎作用的问题有待探讨。本研究以UC患者和肠炎小鼠模型为研究对象,以健康人为对照,以肠易激综合征(IrritableBowelSyndrome,IBS)患者为疾病对照,探讨CD19+CD5+CD1d+B细胞的表达与UC的关系,探讨黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B细胞以及TLR/MyD88信号通路的调控作用。目的1.探讨CD19+CD5+CDld+B细胞在UC患者外周血及结肠组织中的表达情况,以及血清相关细胞因子的表达水平；2.通过体外培养实验,探讨黄芩苷对UC患者外周血CD19+CD5+CDld+B细胞及其胞内IL-10的调控作用,探讨黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B细胞内TLR4/MyD88信号通路的影响；3.借助UC动物模型,探讨黄芩苷体内给药对UC模型动物CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及IL-10表达相关信号通路蛋白TLR4/MyD88的调控作用,同时探讨黄芩苷对小鼠DSS肠炎的治疗效果以及TLR4-MyD88-NFκB信号通路的调控。方法一、CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞与UC的相关性研究1.临床患者入选及分组：入选标准：UC患者入选标准参考《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》；IBS患者入选标准参考《肠易激综合征中西医结合诊疗共识意见(2011年)》。患者分组：结合入选标准,将患者分为3组：健康对照组(Control组,n=36)；溃疡性结肠炎组(UC组,n=36)；肠易激综合征组(IBS组,n=27)。2.流式细胞术(FCM)检测外周血CD19、CD5+CDld+B细胞比例；3.激光共聚焦显微镜(LSCM)观察CD19+CD5+CDld+B细胞在人结肠组织中的表达情况；4.免疫组织化学法(IHC)检测TLR2、TLR4、TLR9在结肠组织的表达；5.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α和TGF-β的水平；二、黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞的体外干预作用研究6.体外干预实验细胞入选和分组：入选标准：已入选实验的中度病情UC患者外周血单核细胞；细胞分组：空白对照组、LPS刺激组、LPS+黄芩苷刺激组(LPS+BCLN组)。7.UC患者外周血单核细胞分离；8.UC患者外周血单核细胞分别与不同刺激物共培养48小时,三组刺激物分别为PBS(对照组)、LPS(LPS组)、LPS和黄芩苷(LPS+BCLN组);9.流式细胞术检测CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及胞内IL-10、TLR4和MyD88的表达；10.比较不同刺激物对CD19+CD5+CDld+B细胞比例的影响；11.比较不同刺激物对CD19+CD5+CDld+B细胞IL-10、TLR4和MyD88表达的影响;三、黄芩苷对DSS肠炎小鼠CD19+CD5+CDld+B细胞及相关信号蛋白调控作用研究12.实验动物肠炎模型造模及分组：分组方法：C57BL/6小鼠32只,随机分为4组：对照组(n=8)、DSS组(n=8)、DSS+黄芩苷组(n=8)、DSS+美沙拉嗪组(n=8)。小鼠肠炎模型造模方法：饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(DextranSodiumSulfate,DSS),制成3.5%DSS溶液给DSS组、DSS+黄芩苷组、DSS+美沙拉嗪组小鼠自由饮用,连续7天；13.分别用黄芩苷和美沙拉嗪治疗DSS肠炎小鼠,治疗方案如下：黄芩苷、美沙拉嗪按100mg/kg剂量配制0.3ml的灌胃液,造模成功后给予DSS+黄芩苷组、DSS+美沙拉嗪组小鼠每天两次、连续7天灌胃给药。14.评价DSS诱导的肠炎小鼠模型以及治疗效果：每天观察大鼠的饮食、体重、粪便、毛色、活动和精神状态等情况。记录小鼠体重下降、隐血／便血情况,两者评分总和的平均值为每只小鼠的改良DAI评分(mDAI),用以评估疾病严重程度和治疗效果。15.流式细胞术检测各组小鼠外周血CD19+CD5+CDld+B细胞比例；16.分离结肠组织中的单核细胞,流式细胞术检测结肠组织CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及CD19+CD5+CDld+B细胞的MyD88及IL-10的表达水平；17.Westernblot法检测各组小鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NFκB-p65蛋白的表达水平。18.RT-PCR法法检测小鼠结肠组织中IL-6、IL-10、IL-13、TNF-αmRNA的表达水平。统计方法实验数据用均数±标准差(x±S)表示,用统计软件SPSS19.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)法。分析前对数据进行方差齐性检验,方差齐时用LSD法进行多重比较；方差不齐时用Welch法进行方差分析,多重比较采用Dunnett’sT3法分析；重复测量的资料采用重复测量数据方差分析方法进行比较,如果满足球形检验,则无需矫正；如果不满足球形检验,则采用Greenhouse-Geisser系数来矫正自由度。P<0.05差异有统计学意义。结果一、CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞与UC的相关性研究1.三组间CD19+CD5+CD1d+B细胞比较差异无统计学意义(F=0.402,P=0.670)。2.UC患者血清IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α和TGF-p的水平ELISA检测结果：(1)IL-6：各组间血清IL-6水平差异有统计学意义(F=4.507,P=0.013)。UC组分别较对照组和IBS组升高,差异有统计学意义(P=0.006,P=0.029),对照组与IBS组比较无统计学差异(P=0.688)。(2)IL-10：各组间血清IL-10水平差异有统计学意义(Welch=129.474,P=0.000)。UC组较对照组和IBS组升高,差异有统计学意义(P=0.000),IBS组血清IL-10水平较对照组降低,差异有统计学意义(P=0.002)；(3)IL-13：各组间血清IL-13水平差异有统计学意义(F=4.288,P=0.016)。UC组和IBS组血清IL-13水平较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.019,P=0.010),UC组与IBS组相比无统计学差异(P=0.696)；(4)IL-17：各组间血清IL-17水平差异有统计学意义(F=27.27,P=0.000)。UC组较IBS组和对照组升高,差异有统计学意义(P=0.000),IBS组较对照组降低,差异有统计学意义(P=0.040)；(5)TNF-a:各组间血清TNF-α水平差异有统计学意义(F=16.669,P=0.000),UC组较对照组和IBS升高,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.011),IBS组较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.000)；(6)TGF-p：各组间血清TGF-p水平差异有统计学意义(Welch=71.804,P=0.000),UC组较对照组和IBS组升高,差异有统计学意义(P=0.000)IBS组较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.021)。3.TLR2、TLR4、TLR9在结肠组织中的表达(1)TLR2：三组间TLR2表达水平有统计学差异(F=10.399,P=0.001)。UC组高于IBS组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001)。IBS组和对照组之间差异无统计学意义。(2)TLR4：三组间TLR4表达水平有统计学差异(F=18.699,P=0.000)。UC组高于IBS组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。IBS组和对照组之间差异无统计学意义(P=1.000)。(3)TLR9：三组间TLR9表达水平有统计学差异(F=41.533,P=0.000)。UC组高于IBS组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.019)。IBS组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。4.CD19+CD5+CDld+B细胞在结肠组织中的分布情况：LSCM检测结果显示,CD19+CD5+CDld+B细胞均表达于三组结肠组织中。其比例三组间均无差异(F=0.728,P=0.486)。二、黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞的体外干预作用研究5.黄芩苷上调UC患者PBMC中CD19+CD5+CDld+B细胞的比例：各组间CD19+CD5+CD1d+B细胞比例有统计学差异(F=16.361,P=0.000)。LPS+BCLN刺激组高于LPS刺激组和PBS对照组,差异有统计学意义(P=0.004,P=0.026)。LPS刺激组高于PBS对照组,差异有统计学意义(P=0.033)。6.黄芩苷对UC患者CD19+CD5+CDld+B细胞TLR4、MyD88、IL-10表达的影响(1)TLR4：三组CD19+CD5+CD1d+B细胞的TLR4表达有统计学差异(F=6.575,P=0.006)。LPS+BCLN组CD19+CD5+CD1d+B细胞TLR4的表达较LPS组降低,差异有统计学意义(P=0.002)。LPS+BCLN组与PBS组间无统计学差异(P=0.154)。(2)MyD88：三组CD19+CD5+CDld+B细胞MyD88的表达无统计学差异(F=1.745,P=0.199)。(3)IL-10：三组CD19+CD5+CDld+B细胞的TLR4表达有统计学差异(Welch=4.577,P=0.035)LPS刺激组CD19+CD5+CDld+B细胞IL-10的表达较PBS组和LPS+BCLN组升高,差异有统计学意义(P=0.045,P=0.041).LPS+BCLN组与PBS组间无差异(P=0.994)。三、黄芩苷对DSS肠炎小鼠CD19+CD5+CDld+B细胞及相关信号蛋白调控作用研究7.造模后小鼠一般情况变化(1)正常对照组：小鼠毛色光润、反应灵敏、活动、饮食及二便正常。(2)DSS模型组：第3天开始行动异常(懒动、拱背、扎堆)、饮食减少、体重下降、毛色无光、腹泻,造模第4天出现大便隐血实验阳性和粘液血便,第7天达到高峰。血便情况持续至第11天开始有部分减轻。(3)DSS+BCLN组：DSS造模后1-7天情况同DSS组；第8天持续腹泻、便血或隐血,第10天开始部分小鼠血便情况好转,饮食及活动情况较DSS组好。第12天便血普遍好转。(4)DSS+MSLZ组：DSS造模后1-7天情况同DSS组；第8天持续腹泻,第9天开始部分小鼠便血情况好转,饮食及活动情况较DSS组好。第11天便血普遍好转。8.肠炎模型小鼠mDAI评分情况经重复测量方差分析检验,造模组(DSS组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组)小鼠mDAI评分随时间的变化而变化,时间存在主效应(F=556.751,P=0.000),造模组各组存在主效应(F=439.921,P=0.000),造模组与对照组比较,从第三天开始,差异有统计学意义(均P=0.000)。造模组之间比较无统计学差异(P=0.418,P=0.260,P=0.059)。第8天起停止DSS给药,各组给予相应药物治疗,DSS组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组mDAI评分随时间变化而变化,时间存在主效应(F=108.323,P=0.000),各组存在主效应(F=1004.906,尸=0.000).DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组mDAI评分较DSS组降低,差异有统计学意义(均尸=0.000):DSS+MSLZ组较DSS+BCLN组降低,差异有统计学意义(P=0.016)。9.各组小鼠外周血中CD19+CD5+CDld+B细胞比例DSS组、DSS+BCLN组、DSS+MSLZ组和正常对照组小鼠外周血CD19+CD5+CDld+B细胞比例比较,差异无统计学意义(F=1.453,P=0.249).10.各组小鼠结肠组织CD19+CD5+CDld+B细胞比例DSS组、DSS+BCLN组、DSS+MSLZ组和正常对照组小鼠结肠组织中CD19+CD5+CDld+B细胞比例比较,差异无统计学意义(F=0.932,P=0.438).11.TLR4.MyD88及IL-10在小鼠结肠组织CD19+CD5+CDld+B细胞中的表达情况(1)TLR4：各组间CD19+CD5+CDld+B细胞TLR4的表达有统计学差异(F=4.626,P=0.009)。DSS模型组CD19+CD5+CDld+B细胞TLR4表达较对照组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组增高,差异有统计学意义(P=0.01,P=0.001,P=0.026)。LPS+BCLN组和DSS+MSLZ组间无统计学差异。(2)MyD88：各组间CD19+CD5+CDld+B细胞MyD88的表达有统计学差异(F=3.705,P=0.023)。DSS模型组CD19+CD5+CDld+B细胞MyD88表达较DSS+MSLZ组增高,差异有统计学意义(P=0.002)。对照组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组无统计学差异(P=0.905,P=0.092)。(3)IL-10：各组间CD19+CD5+CDld+B细胞IL-10的表达无统计学差异(F=0.766,P=0.523)。12.TLR2、TLR4、TLR9在小鼠结肠组织中的表达情况(1)TLR2：各组小鼠结肠组织TLR2的表达有统计学差异(F=38.862,P=0.000)。DSS模型组高于对照组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组,差异有统计学意义(均P=0.000)。DSS+BCLN组较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.000)。DSS+MSLZ组和对照组之间无统计学差异(P=0.055)。(2)TLR4：各组小鼠结肠组织TLR4的表达有统计学差异(F=29.428,P=0.000)。DSS模型组高于对照组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组,差异有统计学意义(均P=0.000)。DSS+BCLN组,DSS+MSLZ组和对照组之间差异无统计学意义(P=0.454,P=0.140)。(3)TLR9：各组小鼠结肠组织TLR9的表达有统计学差异(F=4.581,P=0.010)。DSS模型组高于对照组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组,差异有统计学意义(P=0.006,P=0.025,P=0.002)。DSS+BCLN组、DSS+MSLZ组和对照组之间差异无统计学意义(P=0.538,P=0.698)。13.各组小鼠结肠组织TLR4/MyD88/NFκB-p65信号蛋白的表达情况(1)TLR4：各组小鼠结肠组织TLR4表达有统计学差异(F=5.391,P=0.003)。DSS组较DSS+BCLN组、DSS+MSLZ组和对照组升高,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.010,P=0.006)；其中DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组较DSS组降低,差异有统计学意义(P=0.010,P=0.006)；DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组间无统计学差异。(2)MyD88：各组小鼠结肠组织MyD88表达有统计学差异(F=5.809,P=0.003)。DSS组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组均较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.001,P=0.003,P=0.004);DSS组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组间无差异(P=0.599,P=0.551)。(3)NFKB-p65:各组小鼠结肠组织N[FκB-p65表达有统计学差异(F=30.219,P=0.000)。DSS组较DSS+BCLN组、DSS+MSLZ组和对照组升高,差异有统计学意义(均P=0.000)；DSS+MSLZ组较DSS+BCLN组和对照组降低,差异有统计学意义(P=0.017,P=0.018)。14.小鼠结肠组织细胞因子IL-6、IL-10、IL-13、TNF-amRNA表达情况(1)IL-6：各组小鼠结肠组织IL-6mRNA水平有统计学差异(F=9.084,P=0.000)。DSS组较对照组和DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组升高,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001,P=0.000)。(2)IL-10：各组小鼠结肠组织IL-10mRNA水平有统计学差异(F=19.575,P=0.000)。DSS组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组较对照组升高,差异有统计学意义(均P=0.000)。DSS+BCLN组较DSS组和DSS+MSLZ组升高,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.002)。DSS+MSLZ组与DSS组比较无统计学差异(P=0.787)。(3)IL-13：各组小鼠结肠组织IL-13mRNA水平有统计学差异(F=10.423,P=0.000)。DSS组较对照组和DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组升高,差异有统计学意义(P=0.001,P=0.000,P=0.000)。(4)TNF-α：各组小鼠结肠组织IL-13mRNA水平有统计学差异(F=6.613,P=0.002)。DSS组较对照组、DSS+BCLN组和DSS+MSLZ组和升高,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001,P=0.005)。结论1.UC患者外周血CD19+CD5+CDld+B细胞比例与健康人和IBS患者相比无差异,提示CD19+CD5+CDld+B细胞比例高低与UC的发生无相关性；2.黄芩苷体外刺激UC患者PBMC后,可上调UC患者CD19+CD5+CDld+B细胞的比例,但未能上调CD19+CD5+CDld+B细胞IL-10及其相关信号分子TLR4、MyD88的表达。3.黄芩苷灌胃给药未能上调DSS肠炎小鼠外周血及结肠组织CD19+CD5+CDld+B细胞的比例,未能上调CD19+CD5+CDld+B细胞内TLR4、MyD88和IL-10的表达,提示黄芩苷未能通过TLR4/MyD88信号通路促进CD19+CD5+CDld+B细胞调节功能的发挥；4.黄芩苷治疗能上调小鼠结肠组织抑炎细胞因子IL-10的转录水平,下调IL-6、IL-13和TNF-α等细胞因子的转录水平,从而缓解DSS诱导的结肠炎症。黄芩苷对DSS肠炎的治疗作用可能与下调小鼠结肠组织炎症细胞TLR4/NFκB-p65信号通路蛋白的表达有关。
【作者】冯锦山；
【导师】郑学宝；
【作者基本信息】南方医科大学，中西医结合临床，2014，博士
【关键词】调节性B细胞；CD19~+CD5~+CD1d~+B淋巴细胞；溃疡性结肠炎；炎症性肠病；黄芩苷；

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