云南高原程海湖沉积物中的细菌多样性研究

【摘要】湖泊沉积物是一个由多种生物参与的、物质发生频繁交换的有机、无机混合体。外界营养物质的持续输入及环境条件的改变等因素都是造成沉积物中微生物群落变化原因。微生物在湖泊沉积物中的营养物质循环和化合物降解中起着至关重要的作用,同时沉积物也为微生物的各种代谢活动提供场所。沉积物的多种环境因子的变化都能影响其沉积物环境微生物群落的组成和结构。因此研究湖泊沉积物中的微生物群落结果及其多样性将会增强我们对湖泊生态系统的进一步认识。本研究从云南高原程海湖中采集沉积物,用免培养法(DGGE指纹图谱技术,16SrRNA基因克隆测序和454测序技术)和纯培养法研究沉积物中细菌群落组成和分布。比较分析程海湖各沉积物样点细菌多样性异同,分析细菌多样性与环境非生物因子的相关性,以期较全面、系统的了解程海湖沉积物中细菌的多样性,从而为深入开展程海湖中微生物资源的研究、保护及开发利用奠定基础。DGGE指纹图谱技术研究结果表明,程海湖沉积物中细菌有较高的丰度和丰富的多样性。以物种的丰度和多样性为依据,对沉积物中细菌DGGE指纹图谱聚类分析,结果表明14个程海沉积物样品聚成三簇。根据采样点周围生境和DGGE指纹图谱聚类分析结果,选出6个代表性沉积物样品,应用16SrRNA基因克隆序列分析法和纯培养分离方法,系统、深入的研究程海湖沉积物中细菌多样性及其与环境非生物因子的相关性。基于16SrRNA基因分析法从程海湖6个沉积物获得2715条高质量克隆序列,进一步对其进行的系统发育分析结果显示：程海沉积物中存在丰富的细菌多样性,其中有15.2%(415条克隆序列)的细菌克隆序列经RDP分类工具不能确定其分类地位；程海沉积物中的2300条细菌克隆序列归属于细菌域的19个门(Phylum):Actinobacteria,Chloroflexi,Firmicutes,Cyanobacteria,Acidobacteria,Verrucomcrobia,Planctomycetes,Bacteroidetes,Proteobacteria,Armatimonadetes,Caldiserica,Deferribacteres,Gemmatimonadetes,Spirochaetes,Chlorobi,Nitrospira,Elusimicrobia和两个候选门WS3和TM7；程海沉积物中细菌群落组成存在明显的空间分布差异,湖边沉积物的细菌多样性明显的高于湖泊中心沉积物的细菌多样性；2715条克隆序列代表666个OTU,仅有24个OTU是6个沉积物样品共有的。聚类分析和主相关性分析(PCoA)显示：6号沉积物样点与其它五个样点相比,细菌群落丰度和多样性差别较大,6号样点细菌多样性最高。Chloroflexi,Betaproteobacteria,Deltaproteobacteria,Gammaproteobacteria和Firmicutes是程海湖沉积物中的主要细菌类群。程海湖沉积物样品中的细菌群落组成与环境非生物因子相关,Actinobacteria,Planctomycetes,Alphaproteobacteria和Chlorobi的丰度与程海沉积物样品中的总磷含量(TP)显著负相关,且.RDA分析结果显示程海沉积物中总磷的含量是影响其微生物群落组成的最主要的环境非生物因子。454高通量测序研究程海沉积物细菌多样性及其与环境非生物因子的相关性,6个沉积物中共获得38977条有效序列,通过质量检测、嵌合体检测和Silva数据库比对,排除8471条序列,得到30506条高质量序列。去除barcode标签序列和前引物序列后,序列平均长度为433bp。以97%相似性划分OTU,30506条序列共划分为4802个OTU。通过与Silva数据库比对,其中有1076个OTU,不能分类到目前已知的任何细菌门级分类单元(unclassifiedBacteria)。剩余3726个OTU归属于细菌域的24个系统发育类群,其中Proteobacteria和Chloroflexi是程海沉积物种主要的细菌类群。多样性统计分析,6号样点细菌多样性最高,5号沉积物中细菌多样性最低。Pearson相关性和RDA分析结果显示总磷(TP)的含量是影响程海微生物群落组成的主要环境非生物因子。尽管454高通量测序获得的数据量要比克隆测序法高出一个数量级,然而这两种测序方法获得相似的主要的细菌类群及相似的与环境因子的相关性。以免培养分析结果和湖泊沉积物中的理化因子为依据,选用或设计四种培养基,对程海湖6个沉积物样品中的可培养细菌进行分离、培养。基于16SrRNA基因序列的系统发育分析研究所分离菌株种群的多样性。研究结果表明,从程海湖沉积物中共分离到148个细菌和典型放线菌物种,分属于细菌域的4个门(Actinobacteria,Proteobacteria,Firmicutes和Bacteriodetes),34个科,60个属。其中29个属(Micromonospora,Microbacterium,Micrococcus,Kocuria,Verrucosispora,Rhodococcus,Streptomyces,Citricoccus,Brachybacterium,Agromyces,Brevibacterium,Polymorphospora,Nocardioides,Corynebacterium,Kytococcus,Dietzia,Ornithinimicrobium,Arthrobacter,Cellulomonas,Jiangella,Agrococcus,Asanoa,Mycobacterium,Nocardia,Williamsia,Kribbella,Promicromonospora,Saccharopolyspora和Nonomuraea)属于Actinobacteria门；16个属(Pseudomonas,Acinetobacter,Brevundimonas,Porphyrobacter,Proteus,Sphingobium,Haematobacter,Amaricoccus,Erythromicrobium,Methylobacterium,Paracoccus,Pantoea,Alcaligenes,Enterobacter,Psychrobacter和Stenotrophomonas)属于Proteobacteria门；14个属(Bacillus,Planococcus,Paenibacillus,Staphylococcus,Jeotgalibacillus,Planomicrobium,Halobacillus,Oceanobacillus,Paenisporosarcina,Exiguobacterium,Aneurinibacillus,Lysinibacillus,Brevibacillus和Solibacillus)属于Firmicutes门；3个属(Myroides,Sphingobacterium和Aquiflexum)属于Bacteroidetes门。其中有11株细菌菌株代表11个潜在的新物种,其它大部分菌株与其系统发育关系密切的典型菌株之间的16SrRNA基因序列都有一定的差异。这些结果揭示了程海湖沉积物中存在丰富的可培养细菌多样性,同时程海沉积物中也蕴藏着较为丰富的新的微生物资源。免培养分析法检测到细菌域的24个门,而纯培养法分离到的菌株归属于细菌域的4个门,甚至有些菌株是用免培养法未检测到的。纯培养分离到的菌株并不都是程海沉积物中主要的细菌类群,说明我们选用或设计的培养基、培养策略适合这些微生物的分离培养,同时也揭示免培养法有一定的局限性。因此,免培养分析法并不能代替纯培养法。既要重视免培养分析法,也要充分认识到纯培养分离方法的重要性。只有两种方法结合使用,才能全面、系统的了解程海湖沉积物中细菌的多样性。
【作者】王永霞；
【导师】文孟良；崔晓龙；
【作者基本信息】云南大学，微生物学，2014，博士
【关键词】程海湖；DGGE指纹图谱；16SrRNA基因克隆；454测序；纯培养法；细菌多样性；

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