1型神经纤维瘤病NF1基因突变研究

【摘要】研究背景第一部分神经纤维瘤病神经纤维瘤病(Neurofibromatosis,NF),又称冯·雷克林豪森病(vonRecklinghausendisease)。典型神经纤维瘤病表现为神经系统、骨骼和皮肤的发育异常。临床类型NF1型：即传统的神经纤维瘤病,占总病例85%以上,表现为大量的神经纤维瘤和咖啡牛奶斑,可见Lisch小结,常不伴发中枢神经系统损害。NF2型：中枢型或听力型,为双侧听神经瘤,咖啡牛奶斑和皮肤神经纤维瘤很少,无Lisch小结。NF3型：混合型,兼有Ⅰ型和Ⅱ型的特征。NF4型：变异型,表现为弥漫性咖啡牛奶斑和神经纤维瘤,可见Lisch小结,可有或无中枢神经系统肿瘤。NF5型：节段型或局限型,神经纤维瘤和咖啡牛奶斑局限于身体的某些特定部位。NF6型：仅咖啡牛奶斑。NF7型：迟发型,30岁以后发病。病因及发病机制本病NF1型至NF4型均为常染色体显性遗传,不同型别外显率不同,由畸变显性基因引起的神经外胚叶异常,常表现为不全型和单纯型,25%-50%的患者家族史阳性,男性较多见。一般认为NF5型由形成合子后的体细胞突变引起,常不遗传给后代。NF1基因位于17q11.2的中央周围区,编码神经纤维蛋白,该蛋白负调控Ras蛋白转导信号。NF2的基因位于染色体22q12.2,为一种肿瘤抑制基因,编码Merlin蛋白(神经鞘蛋白),该蛋白将肌动蛋白细胞骨架连接到细胞表面的糖蛋白上,起负生长调控作用,具有传导抑制信号的功能。已发现大量NFl基因的突变位点,到目前为止,已经验证的突变位点已达1500余个,突变位点涵盖了大部分NF1的外显子。临床表现包括皮肤及皮肤以外的损害。(一)皮肤损害包括皮肤色素斑,神经纤维瘤,及其他皮肤表现。1.皮肤色素斑咖啡牛奶斑是NF1诊断标准的7个核心标准之一。常出生时即有,偶在出生后数月至1年内发生,常多发,除掌跖外,可不规则散在分布于体表任何部位,因大多数皮损呈咖啡色故称咖啡牛奶斑(Cafeaulaitmaecule),呈卵圆或不规则形,大小不一,多随年龄增长而增大、增多。尽管与咖啡加牛奶的颜色相似,但色素的变化从浅棕色至深棕色不等。要符合本病诊断的要求,患者需要六个或更多斑疹,直径>5mm(青春期前)或>15mm(青春期后)。不到1%的未患NF1的5岁以下儿童超过两个及以上的斑疹,如果出现多发性咖啡牛奶斑,将高度提示患有NF1。另一项研究发现,有6个或以上咖啡斑的大多数患者最终将达到NF1诊断标准,通常发生在6岁,这可能性随着咖啡斑的数量和典型形态学表现的增加而增加。一般人群咖啡斑的患病率在3%到36%之间(这取决于被研究的人群),另一方面,多发性咖啡斑存在于正常人群的比例一般为1%。腋窝或腹股沟处雀斑样色素沉着亦为本病的特征,称为Crowe征(Crowe’ssign),是NF1核心诊断标准中最特异的一项。它被认为几乎可以确定诊断。但最近的另一项研究提出,斑点可能会出现于一些斑驳病患者,并不一定代表与1型神经纤维瘤病的并存。依据年龄相关的发生频率,它是仅次于咖啡牛奶斑,一般在3至5岁时发生在腋窝和／或腹股沟。其他部位包括颈部和胸部,嘴唇周围,甚至在成人躯干。然而,这些都不满足美国国立卫生研究院的诊断标准。大小从1到3mm大等,可同咖啡牛奶斑区分开来。泛发性色素沉着也可为NF1的皮肤色素改变。2.神经纤维瘤被认为是NF1另外一个重要的诊断依据,是NF1最常见的表现。由于压迫神经,偶然引起疼痛和进行性功能缺失。神经纤维瘤可发生在身体的任何部位,可以有任何形状,任何大小。皮肤神经纤维瘤在青春期前常不很明显,在整个成人期可能持续生长,包括大小和数量。怀孕是另一个显著生长期。可分为三种类型,即皮肤型、皮下型和丛状型。①皮肤型表现为粉红色、橡胶样有蒂或无蒂的肿瘤,质软,数个至1000个以上,直径从数毫米至数厘米,甚至更大；可累及身体任何部位,但龟头罕见,女性的乳晕和乳头神经纤维瘤对NF1有诊断意义。②皮下神经纤维瘤可硬如象皮。皮肤型和皮下型神经纤维瘤在儿童期开始发生,青春期和妊娠时数量增多,在整个成年期可持续缓慢变大和增多。③丛状型神经纤维瘤出生时即有,对NF1有诊断意义。3.其他皮肤表现青少年黄色肉芽肿,黑色素瘤,青少年黄色肉芽肿-NF1-青少年髓单核细胞白血病三联征等。(二)皮肤以外的损害包括口腔损害,神经病变,眼部、骨骼、内分泌、内脏病变,并可能发生恶性肿瘤。1.口腔损害可有口腔肿瘤,发生于上腭、颊粘膜、舌和唇部；或表现为巨舌症。2.神经病变神经缺陷可为局限性或弥漫性、中枢性或外周性。(1)听神经瘤听神经在脑神经中最常受累,听神经瘤双侧发生时可引起感觉神经性耳聋。(2)视神经胶质瘤发生率约占NF1病例的15%,儿童期出现,80%患者无任何症状,少数出现突眼、视力下降或眼球活动受限,大多数病例为非进行性。(3)其他中枢神经系统病变包括脑积水、脑异位、神经胶质小结、神经管闭合、脊髓脊膜膨出、脑和脊髓肿瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、以及星形细胞瘤和脑膜瘤。(4)周围神经损害可出现感觉异常、神经根痛或臂丛麻痹、癫痫、智力障碍、共济失调等。4.眼病变(1)Lisch小结为虹膜的黑素细胞错构瘤,呈半透明褐色斑点,每只眼平均有25个,常双侧发生,对视力无影响；大多数病例需用裂隙灯检查才能见到；初发于儿童期。Lisch小结很常见,6岁时,15%～20%的儿童和95%的成人有此表现,为美国国家卫生研究院的NF1重要诊断标准之一。(2)其他眼部损害包括脉络膜错构瘤、眼睑神经纤维瘤、双侧视神经萎缩和青光眼,无眼症等。5.骨骼损害包括蝶骨发育不良,长骨皮质变薄(伴有或不伴有假关节),脊柱后侧凸,胫骨弓形,巨头,矮身材。神经纤维瘤病患者2,5二羟维生素D3血浆水平和骨密度明显下降。组织形态学分析不仅揭示了骨小梁体积下降,而且类骨质体积,成骨细胞和破骨细胞的数量增加。另外,钙含量显著下降。6.内分泌异常可伴发肢端肥大症、粘液性水肿、性早熟或延迟、Addison病、甲状旁腺功能亢进、甲状腺髓样癌以及嗜铬细胞癌。7.内脏病变本病根据病变部位,可分为3型：(1)周围型,以多发性皮肤肿瘤和丛状神经纤维瘤为特征,主要累及周围神经,可同时伴内脏和中枢神经系统病变；(2)中枢型,以中枢神经系统和神经根的各种肿瘤的并发为特征,这些肿瘤包括胶质瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤和神经纤维瘤；(3)顿挫型,以肿瘤的数目较少为特点,全身仅几个,以后亦不增多。8.恶变神经纤维肉瘤,或称恶性神经鞘瘤,可发生于神经纤维瘤病患者,但并不常见。在皮肤神经纤维瘤中者称外周恶性神经鞘瘤(malignantperipheralnervesheathtumor,MPNST)),更为罕见。组织病理：(1)咖啡牛奶斑表皮内角质形成细胞及黑素细胞中色素增加,黑素细胞及基底细胞内可见巨大球形黑素颗粒,散在分布,直径可达5μm,多巴(Dopa)反应示黑素细胞密度及活性增加。(2)神经纤维瘤瘤体无包膜,可扩展至皮下脂肪组织,界限常清楚,由神经衣和神经鞘细胞组成,瘤内尚有较多神经轴索增生,小血管丰富。神经鞘细胞呈细长梭形或略弯曲成波形,细胞界限不清,胞质染色呈淡伊红色,两端明显长短不一,排列成波形或涡轮状,间有少数成纤维细胞。特殊染色显示瘤内肥大细胞较多见,常有细长神经纤维穿插于其中,无弹性纤维。丛状神经纤维瘤病累及深部大神经,并见神经束不规则。早期局部神经衣呈黏液瘤样,间质增多,侵袭,并使有髓或无髓神经轴索分隔。神经鞘细胞和胶原纤维增生组成弯曲的条索,周围为黏液样无定形间质。晚期因肿瘤增大,导致正常神经形态无法分辨。诊断标准包括多种,其中NF1主要使用1988年美国国立卫生研究院建立的关于神经纤维瘤病的诊断标准。基于1988年美国国立卫生研究院关于神经纤维瘤病的总结性报告,1型神经纤维瘤病(NFl)需达到以下标准中2条即可诊断：(1)6个或6个以上的咖啡牛奶色斑；(2)腋部或腹股沟区出现雀斑样改变；(3)2个或2个以上的神经纤维瘤；(4)2个或2个以上Lisch小结；(5)视神经胶质瘤(opticpathwaygliomas,OPGs);(6)骨发育异常;(7)一级亲属罹患此病。NF2型神经纤维瘤病的诊断至少需以下1条：(1)CT和MRI检查证明双侧第8对脑神经发生肿瘤；(2)直系亲属患2型神经纤维瘤病以及任何一侧第8对脑神经发生肿瘤,或有以下肿瘤中2种或以上,如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、神经鞘瘤。预防及治疗：目前无理想的治疗方法。主要对症处理,皮损严重妨碍美容、影响功能者,或肿瘤肿大、疼痛并疑有恶变时可行手术切除。恶性外周神经鞘瘤的标准治疗是手术完整切除。咖啡牛奶斑可选择激光(脉冲染料、YAG、红宝石)治疗。Kim等报道了一例采用切削术联合1444nmNd:YAG激光成功治疗多发性皮肤神经纤维瘤。有癫痫发作者应仔细检查病灶,必要时考虑神经外科手术切除,但有复发可能。第二部分1型神经纤维瘤病1型神经纤维瘤病(NF1;OMIM#162200)是一种常见的神经皮肤疾病,以多发性咖啡斑,皮肤皱褶处雀斑样改变,Lisch结节,神经纤维瘤为特征。NFl基因编码神经纤维蛋白,已被证实为NFl的致病基因。神经纤维瘤病的发病率约为1/3500。少见的临床表现包括恶性肿瘤,丛状神经纤维瘤,视神经胶质瘤,学习能力障碍,青少年黄色肉芽肿和骨异常。约50%恶性外周神经鞘瘤(MPNSTs)与1型神经纤维瘤相关皮损有关。90%的NF1病例可发生咖啡斑(Cafe-au-lait,CAL),表现为圆形的淡棕色均一的斑疹,直径从1～2mm至20cm不等。最近报道了一例非常罕见的巨大咖啡斑,边界不规则,累及后背的下半部分,右侧面,双侧臀部和大腿。1型神经纤维瘤病另外一个显著特点是神经纤维瘤,可发生在身体任何部位,形状和大小不一。一般来说,神经纤维瘤瘤体在皮肤内呈圆拱形,质软,饱满,皮肤色至轻度色素沉着,而位于皮下者呈坚实的结节状。神经纤维瘤还可发生在产道,若在宫颈可导致宫颈狭窄和下腹部疼痛。NFl基因,定位于染色体17q11.2,在基因组DNA中约280kb,含有60个外显子,编码神经纤维蛋白,该蛋白由2818个氨基酸残基组成。神经纤维蛋白为Ras的GTP酶活化蛋白GTPaseactivatingprotein,GAP),广泛的表达于多种组织中。迄今为止,已有超过1000个不同的突变被发现,并列于人类突变基因数据库中。大多数突变都导致了截短蛋白(truncatedproteins)表达。研究目的本研究旨在对1型神经纤维瘤病的致病基因NFl突变及其表型-基因型相关性进行研究。借鉴模式生物的研究成果,利用人类样本明确人类自身NFl基因在1型神经纤维瘤病发病中的基因结构及表达变化,丰富NF1基因突变数据库,为进一步深入阐明NFl基因的生物学功能及1型神经纤维瘤病的遗传咨询,产前诊断,基因诊断和未来的基因治疗奠定基础。利用本研究检测结果,结合既往文献,分析NFl的基因型-表型潜在相关性。研究材料和方法抽取两个1型神经纤维瘤病家系、三个散发病例及100例无亲缘关系的正常对照的外周血,提取DNA,设计引物,对NF1基因编码的外显子及外显子内含子交界区域进行基因扩增,PCR产物纯化,并采用Sanger法进行测序,利用BioEdit软件分析比对研究对象的基因序列有无杂合突变,并与基因数据库正常序列进行比对,分析有无纯合突变,同时与SNP数据库和100例正常对照的序列比对排除多态性。通过比较临床和突变数据来分析NF1基因型和表型的潜在相关性。结果(1)临床发现所有患者出生时即出现咖啡斑。家系1先证者,女,3.5岁,躯干、四肢和臀部可见散在分布的咖啡斑,大小不等。其父亲,姑和祖母病情严重,皮损典型,全身可见大量神经纤维瘤和咖啡斑。该家系中所有患者5-6岁时出现神经纤维瘤,10岁以后迅速进展。家系2所有患者神经纤维瘤出现在3岁左右,后逐渐增多,10余岁时达到最多。两个散发病例发病时间分别为23岁和24岁,虽然发病较晚,但病情进展迅速,神经纤维瘤生长快,部分瘤体巨大。神经纤维瘤组织病理学检查,可见神经纤维瘤的典型特征,如梭形细胞增生,粘液样背景和大量的肥大细胞。(2)NFl在1型神经纤维瘤病中的基因变异在两个1型神经纤维瘤病家系和3个散发病例中共发现3个新的突变,分别为c.601T>A,c.871G>T,c.1448A>G,这些新的突变仅在患者中发现,家系中未患病成员及正常对照均为野生型。这些突变分别位于外显子4、内含子6和外显子10,分别导致的氨基酸改变为F201I,E291X,D485G。结论(1)NFl基因的突变c.601T>A,c.871G>T,c.1448A>G可能为相应患者1型神经纤维瘤病发病原因；(2)我们的数据显示NFl基因外显子4,6,10的突变可能影响NF1蛋白的结构和功能,并可能最终影响其生理学功能。
【作者】张启国；
【导师】曾抗；梁燕华；
【作者基本信息】南方医科大学，皮肤病与性病学，2014，博士
【关键词】1型神经纤维瘤；测序；NF1基因；相关性；表型-基因型；

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