乙烯对采后低温冷藏桃果实香气合成调控的分子机理研究

【摘要】桃（PrunuspersicaL.Batsch）属于呼吸跃变型果实，常温贮藏3-5d果实即发生腐败、变质，低温贮藏是目前延长桃果实贮藏时间的主要方法。但是桃属于冷敏果实，低温下容易果实发生冷害，出现果肉褐变、不能正常软化而发绵、出汁率低等现象，其中香味变淡甚至丧失是一个重要冷害特征，严重影响了果实品质。实验室前期研究发现，低温条件下，桃果实果香型香气物质含量较常温显著降低，而清香型香气物质的含量较常温有所增加；施加外源乙烯处理，在一定程度上促进了低温贮藏桃清香型香气向果香型香气的转变，部分清香型香气含量降低，而果香型香气含量上升。低温下施加外源乙烯处理，显著提高了内源乙烯的释放，乙烯合成相关基因ACO的活性降低。以上结果表明，乙烯与果实香气物质合成存在必然联系，但是关于乙烯对香气合成恢复的分子机理尚不清楚。通常代谢产物与代谢底物成正相关，因此很有必要从基因的转录水平，结合香气挥发代谢谱结果，对乙烯参与桃果实香气物质合成的调控作用进行研究。研究的主要结果如下：1、数字基因表达谱测序发现，低温贮藏条件（0℃贮藏30d的桃果实CK2，乙烯处理的桃果实T）对基因的转录表达有较大影响，低温下桃果实中能量代谢和抗病相关基因如ATP酶（ATPase）基因、防御素（cryptdin）基因、病程相关索马甜（thaumatin）基因和几丁质酶（Chitin）基因的表达水平大幅上调，这可能是对适应低温胁迫的一种应激反应。乙烯处理后，这些抗逆基因的表达显著下调，但表达水平仍高于常温贮藏桃样本CK1中的表达量，表明这些基因的转录表达可能受低温和乙烯的共同调控。低温下桃果实发生冷害，可能与能量和抗性相关代谢的失调有关。2、低温贮藏桃样本中，参与硬脂酸合成的硬脂酰CoA硫酯酶基因的表达水平较常温贮藏桃样本显著下调，低温条件下的两个样本（CK2和T）中，该基因的表达水平为0，低温下施加外源乙烯，没有改变硬脂酰CoA硫酯酶基因的转录水平。低温下硬脂酸合成关键基因的转录抑制，使不饱和脂肪酸主要通过亚油/麻酸途径进行。低温下亚油/麻酰CoA硫酯酶基因的表达上调，促进亚/麻油酸的合成，为香气物质合成保证底物的供应。低温导致某些香气物质合成代谢失调的原因，可能由于硬脂酰CoA硫酯酶基因的转录受抑引起硬脂酸代谢失调造成的。3、脂氧合酶LOX基因通过α-亚麻酸途径，参与醛类香气物质的合成。通过对LOX途径中LOX、ALDH、EH等基因家族成员的表达模式分析发现，基因家族不同成员可能参与不同的生物学过程，且它们对乙烯的敏感性不同。乙烯响应因子结合蛋白ERF12为转录抑制因子，该基因的转录受到乙烯正调控，在CK1中的表达水平最高，低温下下调表达，施加乙烯处理表达上调。乙烯响应因子结合蛋白ERF1、ERF2、ERF5为转录激活因子，三基因的转录受到乙烯负调控，在CK2中的表达水平最低。低温下，ERF12下调表达，解除了对LOX基因转录抑制作用，而促进LOX基因的上调表达，乙烯处理后ERF12表达上调，抑制LOX家族基因的转录。乙烯通过ERF1、ERF2、ERF5和ERF12等，转录激活或抑制LOX、ALDH等家族基因的转录表达，从而调控己醛、反-2-己烯醛、反-2-己烯醇等青草型香气物质的合成。4、利用同源克隆和RACE技术，从桃果实中克隆到1个LOX基因，该基因全长2909bp，ORF长2640bp，3’UTR长269bp，编码879个氨基酸，属于LIPOXYGENASE超家族，含有植物LOX家族的两个保守结构域：PLAT/LH2和Lipoxygenase。通过实时荧光定量PCR检测，该基因在CK2样本中较CK1表达大幅下调，T样本中表达较CK2下调，与DGE测序所得的表达变化趋势一致。从‘大久保’果实中共检索到14条LOX同源基因，系统进化分析聚为两簇：13-LOX和9-LOX；有5条基因在DGE中没有检测到表达，另外9条基因中有4条基因的表达受到乙烯负调控，分别是PpLOX4、PpLOX10、PpLOX11和PpLOX12，施加乙烯处理后基本表达下调。5、利用同源克隆和RACE技术，从桃果实中克隆得到1个EH基因，该基因全长1274bp，5′UTR和3′UTR分别长161bp和143bp，最大ORF长972bp，编码323个氨基酸，属于αβ水解酶/折叠酶构型。蛋白的三维结构分析表明，该蛋白具有三位一体的活化中心Asp-His-Asp，以及Y-Y组成的帽子结构；亚细胞定位结果表明，基因定位于叶绿体；实时荧光定量PCR分析结果显示，该基因的转录表达受到低温和乙烯的双重调控，表明该基因可能同时参与多个不同的生理生化过程。6、烷烃类物质是桃果实中含量相对较高的发挥性成分，烷烃类通过CYP716A1的作用氧化生成1-醇，然后在ADH的作用下实现醛和醇的可逆互转。推测烷烃类通过为1-醇的合成提供底物，从而参与桃果实醛类和醇类物质的积累和释放，且乙烯对烷烃类物质的合成起到正向调控的作用。醇类物质的积累可能分别与烷烃-1-单加氧酶CYP716A和ALDH的联动作用及CYP716A和EH的联动作用通过脂肪酸降解途径参与；GDSL基因表达随脂肪酸水平的变化而变化，以维持机体内脂肪酸的动态平衡。
【作者】王贵章；
【导师】王贵禧；
【作者基本信息】中国林业科学研究院，森林培育，2014，博士
【关键词】桃果实；香气成分；DGE；乙烯处理；低温贮藏；

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