抗肿瘤活性化合物呋喃二烯的骨髄抑制毒性及其初步机制研究

抗肿瘤活性化合物呋喃二烯的骨髄抑制毒性及其初步机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-03 分类:参考文献 喜欢:3817
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【摘要】目的制备W/O/W型呋喃二烯复乳,解决呋喃二烯水溶性低、动物难以给药的问题,并评价其对S-180荷瘤小鼠的抗肿瘤活性和初步毒性作用;对呋喃二烯在小鼠体内的毒性靶器官进行确证并进行初步机制研究;研究呋喃二烯诱导SP2\0细胞凋亡的机制和信号传导通路;评价呋喃二烯复乳在大鼠体内的动力学特征、组织分布以及毒性靶器官中的蓄积;最终探讨呋喃二烯在动物体内的毒性作用、毒性靶器官、毒性靶器官中的药物蓄积以及可能的引起毒性的分子机制,为预测其他海洋来源结构类似物的毒性作用提供研究基础和理论依据。方法(1)采用两步乳化法制备W/O/W型呋喃二烯复乳,通过对处方组成和制备工艺进行优化,确定最优处方,通过显微镜下观察和染色两种对W/O/W型复乳进行鉴定,采用HPLC法建立呋喃二烯的体外测定方法,对复乳进行质量控制。以肿瘤移植小鼠为模型,以环磷酰胺为阳性对照药,分别研究腹腔注射和口服灌胃低、中、高三种剂量呋喃二烯复乳后对S-180荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用,同时考察实验小鼠体重、脏器指数、外周血细胞数目、血清主要生化指标和组织病理切片的改变,评价呋喃二烯的药效和毒性作用,初步判断其毒性靶器官;(2)以健康动物为实验对象,小鼠多剂量腹腔注射低、中、高三种剂量的呋喃二烯复乳,考察小鼠体重、脏器指数、外周血细胞数目、血清主要生化指标和组织病理切片的改变,进一步明确呋喃二烯的毒性作用和毒性靶器官。采用Westernblot技术测定小鼠骨髓细胞中凋亡相关蛋白表达的变化,初步考察呋喃二烯致小鼠骨髓抑制的机制。大鼠多剂量腹腔注射低、中、高三种剂量的呋喃二烯复乳,采用超速离心法制备大鼠肝微粒体,通过对肝微粒体中蛋白含量和CYP450含量测定,初步评价呋喃二烯对大鼠肝微粒体CYP450酶的影响;采用HPLC法测定呋喃二烯在肝微粒体中的代谢率并计算酶动力学参数,通过底物探针代谢实验进一步确证其对CYP450酶系各亚型的影响作用。(3)以大鼠为实验对象,采用HPLC-APCI-MS/MS技术,测定大鼠分别尾静脉注射、腹腔注射以及口服灌胃低、中、高三种不同剂量呋喃二烯复乳后的血药浓度,计算药物动力学参数;采用外翻肠囊法分别测定呋喃二烯原药和复乳的累积透过量及肠段残留量;测定大鼠单剂量尾静脉注射、腹腔注射以及口服灌胃呋喃二烯复乳后的组织分布,并对大鼠多剂量腹腔注射和口服灌胃后药物在毒性靶器官中的蓄积进行了监测。(4)以SP2/0为实验细胞株,采用MTT法测定呋喃二烯对体外培养细SP2/0细胞的增殖抑制率,并计算IC50;通过倒置显微镜观察细胞形态的变化;采用流式细胞技术测定呋喃二烯诱导SP2/0细胞的凋亡率、DNA含量以及对细胞周期的影响。采用Westernblot技术检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、Cyt-c、Fas、Fas-L、Caspase-8以及Caspase-3等表达的变化。采用RT-PCR技术检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、8、9mRNA的变化,通过时效和量效关系说明呋喃二烯诱导SP2/0细胞凋亡的信号转导通路。结果(1)两步乳化法制得的W/O/W复乳粒径大小均匀,分散性好,质量稳定,标示含量为99%±2.1%,符合制剂质量要求,可用于动物给药的制剂。腹腔注射呋喃二烯低、中、高三种不同剂量的复乳后,S-180荷瘤小鼠的肉瘤生长均得到一定程度的抑制,抑瘤率分别为18.55%±3.5%、19.82%±2.7%和29.82%±3.4%,与空白复乳组比较具有显著性差异(p<0.05)。高剂量组的抑瘤率与阳性对照组环磷酰胺(33.53%±3.5%)比较无显著性差异(p>0.05)。口服灌胃三种不同剂量的复乳后,与空白复乳组比较,只有高剂量组(20.76%±4.5%)具有显著性差异(p<0.05)。说明腹腔注射组具有一定的抑瘤率,而口服灌胃组的作用较弱。腹腔注射呋喃二烯可显著抑制S-180腹水瘤小鼠腹围的增长(p<0.01),但不能显著延长小鼠的生存时间,预测可能是其毒性引起的小鼠死亡。脏器指数与空白对照组比较,脾脏指数明显升高(p<0.01),其次为肝脏指数(p<0.05)。外周血细胞计数结果显示呋喃二烯可引起小鼠全血血细胞的变化,其中白细胞的降低最为明显(p<0.01),高剂量组还可同时引起红细胞(p<0.05)和血小板的减少(p<0.01)。血清生化指标测定结果显示呋喃二烯可引起血清中ALT、AST、BUN和SCR水平的变化,其中以AST水平的升高最为显著(p<0.01)。组织切片结果显示呋喃二烯给药组小鼠脾脏组织结构被破坏,红髓内出现幼稚粒系细胞髓外造血,提示骨髓造血系统可能是其毒性靶器官。(2)多剂量腹腔注射呋喃二烯低、中、高三种不同剂量的复乳后可引起健康小鼠全血血细胞的变化,其中以白细胞的降低最为明显(p<0.01),高剂量组还可同时引起血小板减低(p<0.05)。同时可引起骨髓造血系统损伤相关血清生化指标EPO、TPO及GM-CSF水平的变化,其中以GM-CSF水平的降低最为明显(p<0.01),高剂量组还可同时引起TPO水平的降低(p<0.05)。肝损伤相关血清生化指标ALT、AST、ALP、MDA及SOD的变化不大,只有高剂量组可引起ALT、AST、ALP和MDA的升高(p<0.05)。脏器指数以脾脏指数的升高最为明显(p<0.01),其次为肝脏指数(p<0.05)。组织切片显示呋喃二烯给药组小鼠的骨髓髓腔内细胞数目减少,且脾脏出现明显的粒系髓外造血,肝脏也出现轻微的粒系髓外造血,提示存在明显的骨髓抑制作用,其他脏器的组织学变化不大。小鼠骨髓细胞Westernblot检测结果显示,呋喃二烯给药组可上调Bax的表达、下调Bcl-2的表达,腹腔注射呋喃二烯低、中、高三种不同剂量的复乳后Bax/Bcl-2的比值依次为:2.22±0.65、5.32±1.56、6.03±2.43,与空白对照组比较p<0.01,存在一定的剂量相关性,且出现明显的Cleavedcapase-3条带,说明呋喃二烯通过诱导骨髓细胞的凋亡导致骨髓抑制。多剂量腹腔注射呋喃二烯低、中、高三种不同剂量的复乳后,超速离心法制备肝微粒体,与空白对照组比较,呋喃二烯中、高剂量组可引起肝微粒体中蛋白含量和CPY450含量的减少(p<0.05)。并且呋喃二烯在经中、高剂量处理过的肝微粒中具有明显的代谢抑制现象,Km和Vmax的值均有一定程度的降低(p<0.05),提示呋喃二烯对CYP450可能存在一定的抑制作用。底物探针实验结果显示:S-美芬妥英和苯妥英在经高剂量呋喃二烯处理过的肝微粒体中的代谢速度与空白对照组比较具有显著性差异(p<0.01和p<0.05),其他底物的代谢速度与空白对照组比较无统计学意义,提示呋喃二烯可能对CYP2B6和2C9存在一定的抑制作用。(3)大鼠尾静脉单剂量注射低、中、高三种不同剂量的呋喃二烯复乳后,其药动学特征符合二室开放模型,t1/2。分别为3.9±2.3、4.3±1.2和4.8±2.1min,t1/2β分别为73.2±7.9、64.2±14.7、69.3±12.1min,表明药物在大鼠体内的分布和消除都较快。曲线下面积(AUC)分别为83231.34±9784.3、151481.88±14573.1和834672.65±67481.43min·ng·mL-1,采用最小二乘法对AUC和剂量进行相关性考察,直线方程为y=16845x-8510.6(r=0.987),表明呋喃二烯在大鼠体内呈现线性药动学特征。单剂量腹腔注射或者口服灌胃给予大鼠低、中、高三种不同剂量呋喃二烯复乳后,低、中剂量基本测不到血药浓度,高剂量组所测得的血药浓度由于数值很小,无法进行药动学参数的求算。外翻肠囊法评价药物吸收的实验结果显示,呋喃二烯原药组在小肠各段60min的累积透过量分别为956±324、657±126、542±148ng,其在小肠各段的残留分别为8654±1654、7684±957、7342±1256ng;呋喃二烯复乳组在小肠各段60min的累积透过量分别为3456±534、3024±368、2687±286ng,其在小肠各段的残留分别为2459±625、2861±589、2103±574ng,累积透过量按十二指肠、空肠、回肠依次减少。组织分布结果显示,大鼠尾静脉单剂量注射呋喃二烯复乳后迅速在体内广泛分布,在脾脏中的浓度最高,其次按肝脏、心脏、肺脏、肾脏、小肠和脑依次减少。单剂量腹腔注射或口服给药后,在小肠中的浓度最高,其次按为脾脏、心脏、肝脏、肺脏、肾脏和脑依次减少。药物蓄积结果显示:大鼠多剂量腹腔注射呋喃二烯复乳后,毒性靶器官中的药物含量在逐渐升高,脾脏中的含药量从第1天的25.3±3.3rng·g-1升高到第7天的43.1±4.1ng·g-1,骨髓中的含药量从第1天的1.6±0.4ng·g-1升高到第7天的5.1±0.5ng·g-1,胸腺中的含药量从第1天的0.9±0.2ng·g-1升高到第7天的2.5±0.2ng·g-1。(4)MTT法检测细胞存活率试验结果显示,呋喃二烯能抑制SP2/0细胞的生长,具有一定的量效关系,经计算IC50为5.2μg·mL-1。通过倒置显微镜观察到呋喃二烯处理过的SP2/0细胞呈现凋亡的形态学特征。经FCM分析,AnnexinV-FITC法实验显示不同浓度的呋喃二烯作用不同时间后SP2/0细胞的凋亡率与对照组相比有统计学差异(p<0.05),并且从DNA组方图上可见到Go-G1期前亚二倍体凋亡峰。Westernblot检测结果显示,随着呋喃二烯作用浓度的增加,细胞中Bax/Bcl-2的比值由1.83+0.6、8.35±4.3升至14.6±5.6,线粒体内的Cty-c由0.7±0.2、0.440.3降至0.5±0.2,胞浆内的Cty-c由2.6±0.7、5.9±1.3升至8.3±2.5,细胞中Fas由1.14±0.42、1.57±0.63升至1.73±0.48,Fas-L由0.39±0.09、0.58+0.26升至0.68+0.32,具有明显的浓度依赖性,并出现了清晰的Cleavedcaspase-9、8和3条带。随着呋喃二烯作用时间的延长,细胞中Bax/Bcl-2的比值由4.26±1.4、10.99±3.5升至14.6±5.6,线粒体内的Cty-c由0.5±0.2、0.3+0.1降至0.2±0.1,胞浆内的Cty-c由5.3±0.8、6.3±1.7升至8.3±2.5,细胞中Fas由0.69±0.21、0.88±0.24升至1.73±0.48,Fas-L由0.38+0.14、0.43±0.21升至0.68±0.32,具有明显的时间依赖性,也出现清晰的Cleavedcaspase-9、8和3条带;Bax,bcl-2,caspase-8,caspase-9,caspase-3的mRNA表达水平随呋喃二烯的浓度和作用时间的不同而变化,具有一定的时效与量效关系。说明呋喃二烯可通过线粒体途径和死亡受体诱导SP2/0细胞凋亡。结论(1)W/O/W型呋喃二烯复乳制备工艺简单,质量稳定,为动物体内的药效学、药动学及毒理学研究提供保障;腹腔注射呋喃二烯复乳对S-180荷瘤小鼠具有一定的抗肿瘤活性,同时主要毒性靶器官可能是骨髓造血系统和肝脏;(2)确证了呋喃二烯在健康小鼠体内的毒性靶器官主要为骨髓造血系统,可通过上调Bax、下调Bcl-2、破坏Bax和Bcl-2之间的平衡诱导骨髓细胞凋亡。呋喃二烯对肝脏的毒性主要表现在对CYP2B6和2C9有一定的抑制作用。(3)大鼠尾静脉单剂量注射呋喃二烯复乳后,其药动学符合二室模型,消除半衰期较短,呈现线性动力学特征。经血管外途径给药后血药浓度低的原因可能是乳滴经毛细淋巴管途径进入大循环后迅速转运至组织,因此不影响呋喃二烯发挥药效以及产生毒性。呋喃二烯在毒性靶器官中的蓄积也是其毒性发生、发展的原因之一。(4)呋喃二烯不引起小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞周期的变化,其诱导SP2/0细胞凋亡是线粒体途径和死亡受体途径共同作用的结果。
【作者】张丽锋;
【导师】李青山;林文翰;
【作者基本信息】山西医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2014,博士
【关键词】呋喃二烯;W/O/W复乳;S-180荷瘤小鼠;抗肿瘤活性;毒性机制;肝微粒体;细胞色素P450;小鼠骨髓瘤细胞;细胞凋亡;药物动力学;

【参考文献】
[1]王一飞.德国与日本对二战史认识的比较研究[D].外交学院,国际关系,2014,硕士.
[2]邹树平,颜海蔚,胡忠策,郑裕国.有机溶剂/缓冲液两相体系中全细胞催化拆分环氧氯丙烷[J].催化学报,2013,07:1339-1347.
[3]马月婷.阿拉善荒漠不同株龄白沙蒿对土壤养分的影响[D].兰州大学,草地营养生物学,2013,硕士.
[4]黄云峰.车间调度和谐范式与多智能体系统情智集成的研究[D].重庆大学,2010.
[5]方秀丽.多波长掺铒光纤激光器线宽压缩技术的研究[D].天津理工大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[6]蒋瑜.基于差别信息树的RoughSet属性约简算法[J].控制与决策.
[7]徐延.我国网络体育新闻传播历史研究[D].北京体育大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[8]陆丽梅.氨基酸型表面活性剂的酶法合成研究[D].浙江工业大学,2012.
[9]易玉红.车联网的速率自适应算法研究与实现[D].浙江工业大学,2013.
[10]陈亮.某航空发动机曲轴扭振特性及减振器失效分析[D].西南交通大学,交通运输工程,2014,硕士.
[11]付小牛.碳氮纳米锥薄膜制备及特性研究[D].复旦大学,光学,2012,硕士.
[12]贾妍.《哥儿》中文译本中的惯用语翻译问题[D].吉林大学,日语翻译,2013,硕士.
[13]李磊.TCDCA与糖皮质激素受体的相互作用及其对活化蛋白-1的影响[D].内蒙古农业大学,基础兽医学,2014,博士.
[14]郑兴波.我国文化产业上市公司成长性研究[D].广西师范大学,国民经济学,2013,硕士.
[15]王淼.网络控制系统分析和网络实验室设计方法研究[D].沈阳建筑大学,控制工程,2012,硕士.
[16]裴悦同.吉林省高师院校公共体育课初级剑术选修内容教学现状及对策研究[D].东北师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[17]陈强.汽车4032铝合金活塞等温挤压工艺研究及数值模拟[D].河南科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[18]王祎.时间信息的表现—计时产品设计研究[D].广东工业大学,设计学,2014,硕士.
[19]李秋元.A公司战略绩效管理系统构建研究[D].浙江工业大学,2013.
[20]方菊芹,陈帆,和红杰,尹忠科.结合局部分类水平集与颜色特征的遥感影像阴影检测[J].自动化学报,2014,06:1156-1165.
[21]赵欣义.网关防毒墙系统设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[22]李芳玲.基于重金属及抗生素双重作用下黄孢原毛平革菌的富集特性和抗性研究[D].湖南大学,环境科学与工程,2014,硕士.
[23]朱麟.交际策略对于中国大学生英语学习的意义[D].江西师范大学,英语教育,2004,硕士.
[24]张海峰,刘晓为,梁迎春,张晓舒,朱敏瑜.热压-喷涂法制备PMMA超疏表面涂层[J].天津大学学报.
[25]刘梦.Sfmbt2基因第十内含子携带的microRNA-466a-3p作为重要的转录后调节因子调节小鼠OREBP/Nfat5的表达并影响小鼠的渗透调节和尿液浓缩机制[D].厦门大学,细胞生物学,2014,硕士.
[26]吕鹏飞.聚能爆破煤体增透及裂隙生成机理研究[D].中国矿业大学(北京),安全技术及工程,2014,博士.
[27]张俊才,黄万杰.BP神经网络在医疗器材需求预测中的应用[J].医疗卫生装备,2004,04:8-9.
[28]叶海山.支持向量机改进及其应用[D].浙江大学,模式识别与智能系统,2012,硕士.
[29]卢思洁.我国金融控股公司法人治理结构研究[D].江西财经大学,民商法,2013,硕士.
[30]李建强.原位固相合成MgO晶须及其生长机理研究[D].成都理工大学,材料工程,2013,硕士.
[31]贾艳梅.高速动车车轴视觉测量技术研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[32]宋薇.石家庄农业循环经济发展路径研究[D].石家庄经济学院,人口、资源与环境经济学,2012,硕士.
[33]戴颖.翻译过程中意义的哲学阐释[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2004,硕士.
[34]牛铭姣.论公司社会责任的法律化[D].山西财经大学,经济法,2013,硕士.
[35]任晓洁.外商直接投资流入对金砖国家经济的影响[D].山东财经大学,国际贸易学,2014,硕士.
[36]徐岩红.永乐宫壁画艺术中的科学技术初探[D].山西大学,科学技术哲学,2004,硕士.
[37]任秀丽.美国媒体对两次海湾战争的报道比较[D].外交学院,英语语言文学,2004,硕士.
[38]代子阳.基于超高压五轴水切割机床加工的后置处理的研究[D].华侨大学,机械工程,2014,硕士.
[39]汤哲夫.益阳市公益性水利工程项目后评价指标、方法及对策[D].国防科学技术大学,公共管理,2013,硕士.
[40]张苗.黑河中游种植结构真实性检验研究[D].甘肃农业大学,水土保持与荒漠化防治,2013,硕士.
[41]张韶琳.基于Web和数据挖掘的个性化服务系统的设计与实现[D].北京工业大学,2003.
[42]郭乃宁.近十年来温度测量的发展概况(连载之一)[J].宇航计测技术.1988(02)
[43]潘进.监测大气环境二氧化硫浓度的硅传感技术研究[D].重庆大学,应用化学,2003,硕士.
[44]邸秀娟.语文课程中古代诗歌教学与中学生情感教育[D].华中师范大学,学科教学论,2003,硕士.
[45]王卓瑾,吴杰,田龙江,孟庆民.计算机辅助业务测评管理软件的开发[J].一重技术.1999(03)
[46]娜迪娅·纳司尔.吉尔吉斯斯坦国立民族大学汉语教学模式调查研究[D].新疆师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[47]张涛.HINOC网络MAC协处理器地址转发表功能的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2011,硕士.
[48]矫慧.聘任制下高校教师合法权利的法律保障与救济[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[49]刘丽辉.唐山方言词尾“儿”的读音研究[D].河北大学,汉语言文字学,2003,硕士.
[50]汪新凡,王坚强,杨恶恶.基于二元联系数集结算子的多准则群决策方法[J].控制与决策,2013,11:1630-1636.

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