MiR-34a通过下调SIRT1抑制乳腺癌干细胞的机制研究

【摘要】乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居全世界女性肿瘤首位。约有30%的患者即便在疾病早期治疗，最终仍会复发、转移。在诊断时即发生转移的患者，常规的治疗通常最初能够有效的控制疾病的发展，但随着时间的发展，大多数患者最终会病情恶化。为了减少病死率，研发新的治疗策略，这就需要我们充分掌握乳腺癌细胞的分子生物学特点。研究发现肿瘤细胞中存在着一小部分干细胞样的细胞，这部分细胞具有自我更新和特定分化的能力，并在维持肿瘤生长、血管生成及促进肿瘤侵袭转移中起决定性作用，被命名为肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)。到目前为止，已在乳腺癌、白血病、胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌等恶性肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在。2003年Al-Hajj等首次在乳腺癌标本中分离出乳腺癌干细胞，发现几百个Lin-CD44+CD24-/lowESA+细胞在NOD/SCID小鼠中就可以形成肿瘤。乳腺癌干细胞的存在增强了乳腺癌的增生、侵袭和转移能力。同时，乳腺癌干细胞通常对常规化疗耐药，被认为是治疗失败的原因。因此，目前如何根除肿瘤干细胞成为学者们研究的热点。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为21~23个核苷酸的小分子非编码RNA，在多种生物学过程中起着重要的调节作用。miRNA可以通过与靶基因mRNA的特定位点碱基互补配对结合，抑制该蛋白的表达或诱导其mRNA的降解，从而参与基因的表达调控。miRNA可对肿瘤相关基因进行调节，在这个过程中，其可作为癌基因也可作为抑癌基因。在多种肿瘤组织中，观察到了miRNA的低表达。因此可以通过调控miRNA在肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞中的表达水平来寻求一种全新的治疗策略。miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c。研究表明抑癌基因p53可直接诱导miR-34表达,从而诱导细胞凋亡和细胞周期停滞。miR-34a在乳腺癌的增殖、侵袭和转移过程中都起着重要作用。新近研究发现，miR34a对前列腺癌、胰腺癌干细胞和胃癌干细胞均有一定的抑制作用。SIRT1是已经证实的miR-34a的靶基因之一。SIRT1是酵母沉默信息调节因子2（silentinformationregulator2,SIR2）的同源蛋白，是一种依赖NAD+组蛋白去乙酰化酶。SIRT1的去乙酰化酶作用不局限于组蛋白，还有一些非组蛋白，比如肿瘤抑制基因p53。SIRT1可通过调节靶基因的乙酰化状态来调控多种信号通路。SIRT1的功能涉及细胞的能量代谢、衰老和肿瘤等诸多方面。SIRT1是细胞凋亡过程中的抑制因子。SIRT1通过将p53第382位赖氨酸残基去乙酰化而抑制p53的活性，降低其对下游靶基因的激活作用，并由此减少由其诱导的细胞凋亡。本研究首先分选出MCF-7细胞系中CD44+/CD24-的乳腺癌干细胞群。应用qRT-PCR和Westernblotting等技术检测乳腺癌干细胞群中miR-34a及其靶基因SIRT1的表达。其次，采用化学合成的miR-34a的mimics和inhibitors来调节miR-34a在MCF-7细胞系中的表达。同时，通过慢病毒载体来稳定且较长时间地调节miR-34a的表达。应用shRNA-SIRT1真核表达载体沉默SIRT1作为过表达miR-34a的阳性对照，研究miR-34a对MCF-7细胞增殖、侵袭转移和凋亡的影响，以及其对乳腺癌干细胞抑制作用的可能机制。将miR-34a过表达慢病毒载体感染的细胞株及稳定下调SIRT1的细胞株分别接种于裸鼠，在体内观察miR-34a对乳腺癌干细胞的抑制作用。第一部分MiR-34a及其靶基因SIRT1在乳腺癌干细胞中的表达目的：探讨miR-34a及其靶基因SIRT1在乳腺癌干细胞中的表达情况，为进一步研究其在乳腺癌干细胞中的功能奠定基础。方法：采用流式细胞仪和免疫磁珠法从无血清悬浮培养的乳腺癌细胞中分选CD44+/CD24-乳腺癌干细胞群和非干细胞群。采用荧光定量qRT-PCR检测miR-34a的表达。并通过qRT-PCR和Westernblotting等技术检测SIRT1的表达情况。结果：流式细胞仪分选出的CD44+/CD24-细胞群约占细胞总数的9.90±3.54%，免疫磁珠分选出的分选出的CD44+/CD24-细胞约占细胞总数的7.20±4.06%，且均具有较高的成球率。在乳腺癌干细胞中miR-34a的表达降低，与非乳腺癌干细胞和未分选的MCF-7细胞之间比较具有显著性差异（p＜0.05)。SIRT1在乳腺癌干细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显高于非乳腺癌干细胞及未分选的MCF-7细胞（p＜0.01)结论：流式细胞仪和免疫磁珠两种分选方法均可以成功的分离出乳腺癌干细胞，两种方法各有优点。miR-34a在乳腺癌干细胞中低表达，而其靶基因SIRT1则呈现出较高的表达水平。miR-34a与SIRT1可能在乳腺癌干细胞干性的维持与自我更新中起着一定的作用第二部分MiR-34a靶向调控SIRT1基因的表达研究目的：在乳腺癌MCF-7细胞系中建立过表达或下调miR-34a的细胞模型，并构建稳定下调SIRT1的表达载体及细胞模型。方法：采用化学合成的miR-34a的mimics或inhibitors转染乳腺癌MCF-7细胞，qRT-PCR验证miR-34a的表达。慢病毒载体过表达miR-34a并筛选出稳定感染细胞株。设计SIRT1基因的shRNA，干扰乳腺癌MCF-7细胞中SIRT1的表达。采用qRT-PCR和Westernblotting技术检测SIRT1mRNA和蛋白的表达。结果：转染miR-34amimics的MCF-7细胞中miR-34a表达水平是mimicsNC组及未转染Control组的20余倍，差异均具有统计学意义（p<0.01）。转染miR-34ainhibitors的MCF-7细胞中miR-34a的表达水平是inhibitorsNC组的0.45±0.21倍，是未转染Control组的0.51±0.31倍，差异均具有统计学意义（p<0.05）。LV-miR-34a感染细胞可使miR-34a表达上调，与LV-NC组及未转染Control组比较均具有显著性差异（p<0.01）。ShRNA-SIRT1-3组和ShRNA-SIRT1-4组中SIRT1的mRNA与蛋白水平呈现显著性降低（p<0.05）。过表达miR-34a或者下调miR-34a都对SIRT1的mRNA水平无影响。miR-34amimics可以有效抑制SIRT1蛋白的表达，与mimicsNC组相比较具有显著性差异（p<0.01）。而miR-34ainhibitors组细胞SIRT1蛋白表达上调，与inhibitorsNC组比较具有显著性差异（p<0.05）。结论：利用miR-34a模拟物和抑制物可以有效调控miR-34a在细胞中的表达，并有效改变靶基因SIRT1蛋白的表达水平。成功构建miR-34a慢病毒表达载体，有效调控miR-34a的表达。成功构建了pGPH1/GFP/Neo-shRNA-SIRT1表达载体，其中shRNA-SIRT1-3和shRNA-SIRT1-4均具有较好的干扰效果。第三部分MiR-34a对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用目的：探讨过表达miR-34a抑制裸鼠移植瘤及乳腺癌干细胞的机制方法：将过表达miR-34a和稳定下调SIRT1的细胞株分别接种于裸鼠乳腺部位，观察肿瘤生长情况，并采用免疫组织化学染色、qRT-PCR和westernblotting技术分析相关蛋白的表达情况。结果：过表达miR-34a或下调SIRT1组移植瘤体积较小，生长缓慢。肿瘤组织中SIRT1和ALDH1表达减低。结论：过表达miR-34a能明显抑制裸鼠移植瘤的生长，并可能通过抑制SIRT1蛋白的表达而抑制乳腺癌干细胞。第四部分MiR-34a抑制乳腺癌干细胞的机制研究目的：研究miR-34a对MCF-7细胞增殖、侵袭转移和凋亡的影响，主要探讨其在乳腺癌干细胞中抑制作用的可能机制。方法：采用CCK8和克隆形成试验检测miR-34a水平变化对MCF-7细胞增殖的影响。Transwell迁移和侵袭试验检测miR-34a对MCF-7细胞侵袭转移的影响。流式细胞仪检测miR-34a对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞比例的影响。乳腺球形成试验检验乳腺癌干细胞自我更新情况。Hochest33342和AV/PI双染检测乳腺癌MCF-7细胞的凋亡情况。Westernblotting和免疫荧光细胞化学检测相关蛋白的表达。结果：过表达miR-34a可抑制MCF-7细胞的增殖、侵袭转移。下调miR-34a可促进MCF-细胞增殖、侵袭转移。miR-34a组和shRNA-SIRT1组乳腺癌干细胞比例下降。miR-34a组细胞所形成的乳腺球数量减少48.93±7.48%，shRNA-SIRT1组与shRNA-NC组比较，乳腺球数量减少57.78±6.59%。miR-34a组和shRNA-SIRT1组SIRT1、ALDH1、Nanog和BMI1蛋白的表达均低于相应对照组。Nanog蛋白免疫荧光检测发现miR-34a组和shRNA-SIRT1组荧光低表达。miR-34a组、miR-NC组、shRNA-SIRT1组及shRNA-NC组早期凋亡比例分别9.24±2.34%、1.32±1.73%、5.04±1.69%及2.22±2.06%。经统计分析表明，miR-34a与miR-NC组、shRNA-SIRT1与shRNA-NC组之间比较差异均具有统计学意义（p<0.05）miR-34a可促进MCF-7细胞凋亡。结论：MiR-34a可影响MCF-7细胞的增殖、侵袭转移能力。miR-34a可通过下调SIRT1而抑制乳腺癌干细胞的自我更新，其机制可能与Nanog蛋白表达下调有关。同时，miR-34a抑制乳腺癌干细胞至少部分是通过促进细胞凋亡而起作用。
【作者】马威；
【导师】李连宏；
【作者基本信息】大连医科大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】CD44+/CD24-细胞群；miR-34a；SIRT1；乳腺癌干细胞；MiR-34a；mimics；inhibitors；shRNA；慢病毒；移植瘤；裸鼠；Nanog；凋亡；

【参考文献】
[1]周锡生,陆定原.第一个“五百万”千瓦火电大机组运行成绩初析[J].发电设备.1987(09)
[2]王欢.LXI触发与发现机制研究[D].哈尔滨工业大学,仪器科学与技术,2013,硕士.
[3]唐克斯.额济纳河流域生态环境质量评价研究[D].内蒙古师范大学,自然地理,2013,硕士.
[4]张惟,林宝军.改进粒子滤波与预测滤波相结合的单星敏姿态估计[J].控制与决策,2011,05:655-660.
[5]黄芳.厦门建设两岸区域性金融服务中心的思考[D].厦门大学,金融学,2014,硕士.
[6]夏美云,张鸿彦.人工智能发展探讨[J].焦作大学学报,2005,04:61-62.
[7]李帅.基于CAN总线的便携式油液检测仪设计研究[D].吉林大学,系统工程,2014,硕士.
[8]刘静.蛋白酶体抑制剂MG132对非小细胞肺癌生长、转移和放射敏感性的影响及机制的研究[D].苏州大学,放射医学,2013,硕士.
[9]张艺馨.新媒体形势下都市报民生新闻的发展[D].东北师范大学,传播学,2012,硕士.
[10]李盼来.稀土掺杂Ca_2BO_3Cl荧光粉的合成、发光特性及其在白光LEDs中的潜在应用[D].北京交通大学,2013.
[11]刘国荣,阳宪惠.模糊自适应PID控制器[J].控制与决策,1995,06:558-562.
[12]张晓霞.华北人民政府时期医疗卫生事业研究[D].河北师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[13]陈卓明.功能性聚砜酰胺复合材料的制备与表征[D].上海工程技术大学,服装设计与工程,2011,硕士.
[14]吕明旭.从流通体制分析农产品价格波动现象[D].辽宁大学,西方经济学,2012,硕士.
[15]黄哲芳.财务共享服务中心构建研究[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[16]宋玲.民国平政院研究的考察与反思[J].湖南科技大学学报(社会科学版),2014,06:107-112.
[17]杜璨.2013年中国出口信用保险公司河北分公司视频会议同声传译实践报告[D].河北师范大学,英语口译,2014,硕士.
[18]范传鑫.基于改进的RBF神经网络的城市震害损失评估模型[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[19]赵丹.内部审计综合评价指标的量化研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[20]常海雷.客车车身骨架静态强度分析及整车侧翻试验仿真研究[D].长安大学,车辆工程,2013,硕士.
[21]刘亚光.江西省地层多重划分对比研究[J].江西地质科技.1996(02)
[22]李晶.河西绿洲马铃薯膜下滴灌调亏试验研究[D].甘肃农业大学,农业水土工程,2013,硕士.
[23]傅志敏,周志芳.基于数据挖掘法分析陆面过程中地下水效应[J].水电能源科学,2005,03:29-31+91.
[24]马超,胡煜峰,李剑焘,侯延冰,娄志东,邓振波.厚度依赖的Poly(3-hexylthiophene)光伏器件中的磁场效应[J].液晶与显示,2014,05:692-696.
[25]苏晓婷.剖析当代德国公司共决制[D].北京外国语大学,德语语言文学,2014,硕士.
[26]王玉平.我国地方政府融资平台债务的顺周期性与逆周期监管政策研究[D].山东财经大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[27]李岑.CRH6城际列车头车车体结构强度研究[D].北京交通大学,2014.
[28]孟繁玲.漢語“之”“止”“司”“絲”“不”“北”聲同源詞補正[D].广西师范大学,漢語言文字學,2014,硕士.
[29]靳凯.生产制造业库存管理与控制研究[D].大连海事大学,交通运输工程,2012,硕士.
[30]刘志慧.1988年至今英国中小学课程政策的价值变迁研究[D].西南大学,课程与教学论,2014,硕士.
[31]辛策花.褐煤组成对钻井液性能的影响及其改性方法的研究[D].齐鲁工业大学,化学工程,2014,硕士.
[32]李宇航.金代寒食、清明诗研究[D].西北大学,中国古代文学,2014,硕士.
[33]郑乾裕.基于技术指标的股票专家系统研究[D].浙江大学,2001.
[34]刘日.膝内侧副韧带Ⅱ度损伤保守或手术修复对前交叉韧带重建术后膝关节稳定性的影响[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[35]姜宏洲,张学东,张宏勋,李万新,周雷.烧结矿FeO含量智能检测仪的开发[J].冶金自动化,1999,06:13-16.
[36]唐宸.明汪芝《西麓堂琴统》成书时间考辨[J].中国音乐学,2014,03:52-54.
[37]冀瑞珍.房地产价格波动与调控政策研究[D].河北经贸大学,金融学,2012,硕士.
[38]郝增坤.磺胺氯吡嗪钠—二甲氧苄啶溶液在鸡的残留消除研究[D].扬州大学,基础兽医学,2012,硕士.
[39]林形形.含苯并咪唑结构聚醚醚酮的合成及其膜性能研究[D].浙江工业大学,2010.
[40]黄若晓.叶圣陶习惯本旨思想视野下的语文习惯问题探究[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[41]白园飞.微网建模仿真与能量管理控制研究[D].上海电力学院,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[42]盖乾坤.语言接触视域下的当代汉语词汇嬗变研究[D].渤海大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[43]张冬生.基于计算机视觉的三维测量技术[D].华北电力大学（河北）,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[44]张蕾.宋代以来江南地区竹的生态史研究[D].复旦大学,历史地理学,2013,博士.
[45]任香梅.班级管理中人力资源开发研究[D].湖南师范大学,教育,2004,硕士.
[46]李冰.新媒体环境对电视节目制作与传播的影响[J].中国电视,2014,09:17-19+1.
[47]李文平.地理“271”学案教学中的问题研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[48]张娜.关于建立规范化企业购并机制的研究[D].安徽大学,政治经济学,2004,硕士.
[49]许耀,詹亮,王赟,王艳莉,施云海.氟化石墨烯用作一次锂电池正极材料的性能(英文)[J].新型炭材料,2015,01:79-85.
[50]付广,张发强.利用声波时差资料求取烃盖层异常含气浓度的方法及其应用[J].石油地球物理勘探,1998,04:511-518+572.