热休克蛋白90及其亚型在急性白血病患者及细胞株中的表达及其意义

【摘要】背景和目的急性白血病是最常见的血液系统恶性肿瘤之一，其发病是由于骨髓中造血干细胞恶性克隆性增生,从而使正常造血受到抑制。目前,临床上的化疗和/或异基因造血干细胞移植可治愈部分患者，但仍有相当部分的患者出现难治及复发的情况。这与白血病的多药耐药有很大关联，寻找新的治疗靶点及阐明白血病耐药的机制是当前研究的重要课题。同时，异基因造血干细胞移植后并发的移植物抗宿主病是影响患者生存质量的重要因素之一，一定程度上限制了其在临床的广泛应用，探索移植物抗宿主病发生的相关因素也是目前的研究热点之一。热休克蛋白90（Hsp90）广泛存在于多种细胞，在多种恶性肿瘤中高表达，很可能与肿瘤的发生发展有关。同时还发现Hsp90参与机体的免疫调节及抗原的递呈过程。有学者发现，Hsp90的亚型Hsp90α在急性白血病患者中表达增高，而T细胞激活后其亚型Hsp90β表达明显上调，且与p-糖蛋白相关，提示Hsp90α可能参与急性白血病的发生发展，而Hsp90β可能参与移植物抗宿主病的发生，以及难治和复发急性白血病的耐药过程。本研究旨在研究热休克蛋白90（Hsp90）及其亚型(Hsp90α及β)在治疗各阶段急性白血病患者的骨髓单个核细胞及白血病细胞株中的表达情况，分析其表达差异，观察临床转归与Hsp90、Hsp90α及β表达的联系。通过Hsp90抑制17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)作用于白血病细胞株，观察Hsp90在白血病细胞增殖与凋亡中的作用。通过细胞转染技术观察Hsp90α及β在白血病细胞增殖与凋亡中的作用，以及17-DMAG对Hsp90α及β表达的影响。材料和方法：第一部分：①收集白血病细胞株的细胞并提取治疗各阶段急性白血病患者的骨髓单个核细胞及血清，通过半定量PCR技术检测Hsp90在细胞株及骨髓单个核细胞中的基因的表达水平，通过ELISA技术检测Hsp90在血清中的蛋白表达水平。②通过临床数据统计，观察急性白血病患者临床转归与Hsp90基因和蛋白表达的联系。③收集Jurkat及K562细胞，应用Hsp90抑制剂17-DMAG作用于两种细胞株，通过半定量PCR检测Hsp90的基因表达，WST技术检测17-DMAG对细胞增殖的影响，AnnexinV流式细胞术检测细胞凋亡。第二部分：①收集白血病细胞株的细胞并提取治疗各阶段急性白血病患者的骨髓单个核细胞及血清，通过荧光定量PCR及Westernblotting技术检测Hsp90α在细胞株及骨髓单个核细胞中的基因和蛋白的表达水平，通过ELISA技术检测Hsp90α在血清中的蛋白表达水平。②通过临床数据统计，观察急性白血病患者临床转归与Hsp90α基因和蛋白表达的联系。③收集Jurkat及K562细胞，利用Hsp90α干扰质粒，通过脂质体2000转染两种细胞株，通过荧光定量PCR检测Hsp90α的基因表达，Westernblotting检测Hsp90α的蛋白表达，WST技术检测干扰对细胞增殖的影响，AnnexinV流式细胞术检测细胞凋亡情况。④收集Jurkat及K562细胞，应用Hsp90抑制剂17-DMAG作用于两种细胞株，通过荧光定量PCR及Westernblotting检测Hsp90α的基因和蛋白表达。第三部分：①收集白血病细胞株的细胞并提取治疗各阶段急性白血病患者的骨髓单个核细胞及血清，通过荧光定量PCR及Westernblotting技术检测Hsp90β在细胞株及骨髓单个核细胞中的基因和蛋白的表达水平，通过ELISA技术检测Hsp90β在血清中的蛋白表达水平。②通过临床数据统计，观察急性白血病患者临床转归与Hsp90β基因和蛋白表达的联系。③收集Jurkat及K562细胞，应用RNA干扰技术，利用Hsp90β干扰片段，通过脂质体2000作用于两种细胞株，通过荧光定量PCR检测Hsp90β的基因表达，Westernblotting检测Hsp90β的蛋白表达，WST技术检测干扰对细胞增殖的影响，AnnexinV流式细胞术检测细胞凋亡情况。④收集Jurkat及K562细胞，应用Hsp90抑制剂17-DMAG作用于两种细胞株，通过荧光定量PCR及Westernblotting检测Hsp90β的基因和蛋白表达。结果：第一部分1Hsp90表达情况检测基因和蛋白检测表明，与健康对照组患者相比，所有受检细胞株中Hsp90表达明显增高，同样，初治及异基因造血干细胞移植后患者的表达量也明显增高，尤其是难治及复发患者，其Hsp90表达量最高。初治AML及ALL患者的表达无明显差异。同时，发生移植物抗宿主反应（GVHD）的移植后患者较未发生GVHD的患者Hsp90表达明显增高。2Hsp90相关临床观察初治急性白血病患者中，高表达Hsp90的患者完全缓解率更低，随着初治AL的缓解，Hsp90的表达下降，但疾病复发前其Hsp90表达再次增高，且高于初治时水平。317-DMAG处理白血病细胞17-DMAG作用于Jurkat及K562的细胞后，Hsp90基因表达减少，细胞增殖受抑，且促进Jurkat及K562细胞的凋亡。第二部分1Hsp90α表达情况检测与健康对照组患者相比，初治急性白血病患者的Hsp90α基因和蛋白表达增高，缓解期患者的表达水平与初治患者相似，难治及复发患者和所有受检细胞株中Hsp90α表达更高。初治AML及ALL患者的表达无明显差异，健康人与异基因造血干细胞移植后患者的Hsp90α表达量也无明显差异。2Hsp90α相关临床观察初治急性白血病患者中，高表达Hsp90α的患者完全缓解率更低，随着初治AL的缓解，Hsp90α的表达下降，移植后达到最低，但疾病复发前其Hsp90α表达再次增高，且高于初治时水平。3Hsp90α转染白血病细胞Hsp90α质粒转染Jurkat及K562的细胞后，Hsp90α基因和蛋白表达减少，细胞增殖受抑，且促进Jurkat及K562细胞的凋亡。417-DMAG处理白血病细胞17-DMAG作用于Jurkat及K562的细胞后，Hsp90α基因及蛋白表达减少。第三部分1Hsp90β表达情况检测PCR和Westernblotting检测结果表明，与健康对照组患者相比，所有受检细胞株中Hsp90β基因和蛋白表达明显增高，初治及缓解期患者的表达量也明显增高，尤其是难治及复发患者，其Hsp90β表达量最高。发生移植物抗宿主反应（GVHD）的移植后患者较未发生GVHD的患者Hsp90β表达明显增高。初治AML及ALL患者的表达无明显差异。2Hsp90β相关临床观察高表达Hsp90β的初治急性白血病患者有较低的完全缓解率，随着初治AL的缓解，Hsp90β的表达下降，但疾病复发前其Hsp90β表达再次增高，且高于初治时水平。但是ELISA的结果完全不同，每组患者的Hsp90β蛋白表达均极少，所有分组之间无明显差别。3Hsp90β转染白血病细胞Hsp90β干扰片段转染Jurkat及K562的细胞后，Hsp90β基因和蛋白表达减少(P<0.05)，可抑制细胞增殖，但这种抑制细胞增殖的作用较弱，且不能明显促进Jurkat及K562细胞的凋亡。417-DMAG处理白血病细胞17-DMAG作用于Jurkat及K562的细胞后，Hsp90β基因及蛋白表达减少(P<0.05)。结论：1Hsp90可能在急性白血病的发生发展中起着重要作用，且可以作为预测临床预后的一个指标。Hsp90抑制剂17-DMAG能够抑制白血病细胞株Jurkat及K562细胞的增殖，诱导Jurkat和K562细胞凋亡。该研究为17-DMAG应用临床治疗急性白血病提供了理论基础。2Hsp90α可能在急性白血病的发生发展中起着重要作用，且可以作为预测临床预后的一个指标。Hsp90α选择性抑制剂可作为针对急性白血病患者的一种新的靶向治疗方法，17-DMAG可抑制Hsp90α基因及蛋白的表达。3Hsp90β与GVHD的发生有关，可用于移植后预测GVHD的发生，Hsp90β选择性抑制剂可作为GVHD的一个新的治疗靶点。Hsp90β在难治及复发患者中表达明显增高，可能与白血病耐药有关，17-DMAG可抑制Hsp90β基因及蛋白的表达。
【作者】田文亮；
【导师】孙玲；
【作者基本信息】郑州大学，内科学，2014，博士
【关键词】白血病；GVHD；Hsp90；表达；17-DMAG；转染；增殖；凋亡；

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