核桃砧木对树体影响的DNA甲基化调控机制研究

【摘要】嫁接一方面保持了品种性状相对一致性，另一方面不同砧木也会明显改变树体的表型。砧木如何影响接穗表型性状，其分子机制有待深入研究。本研究将‘上宋-14’核桃品种分别嫁接到‘中宁奇’和‘宁优’砧木上，发现核桃嫁接苗树体在表型性状和生理特性（如生长量、光合特性等）发生明显改变，进而对基因组DNA甲基化研究发现，同为‘上宋-14’，嫁接到‘中宁奇’和‘宁优’砧木上，其基因组DNA甲基化水平和模式发生了变化，对甲基化模式差异位点进行测序发现，有些位点序列与光合作用和代谢密切相关。该研究证实了核桃砧木通过影响基因组DNA甲基化水平和模式，进而对树体生长发育产生影响，结果丰富了人们对砧木影响树体生长势的认识。本研究所取得的主要结果如下：（1）建立了优化的核桃基因组DNA甲基化研究实验体系。以核桃子叶为试材，比较了3种DNA提取方法，发现改良高盐CTAB法获得的基因组DNA质量最好，从90对引物组合中筛选出了43对多态性高、电泳谱带清晰、谱带分离状态好的MSAP引物组合，建立优化了核桃基因组DNA甲基化研究的MSAP实验体系。应用建立的优化MSAP实验体系对核桃叶片基因组DNA的甲基化修饰水平进行了分析，共扩增出1060条清晰可辨且可重复条带，对14个核桃基因组DNA甲基化修饰位点进行回收、克隆与测序，BLASTn分析表明核桃叶片包括转录因子在内的多种类型的DNA序列中均存在甲基化修饰现象；（2）利用MSAP技术对核桃同树龄同品种不同组织（成熟叶片组织、当年生嫩茎韧皮部组织、当年生根韧皮部组织、花粉组织、子叶组织和青皮组织）全基因组DNA甲基化进行分析，共扩增出972条清晰可辨的谱带，核桃同一品种不同组织之间基因组DNA甲基化水平差异不显著，其甲基化模式变异频率在0.199~2.493%之间（表3-5），其中，子叶组织相对于花粉组织的CG超甲基化（CG-hyper）变异频率最高（2.493%，表3-5），叶片组织相对于茎韧皮部组织的CHG超甲基化（CG-hyper）变异频率最低（0.199%，表3-5），表明相同树龄的同一核桃品种不同组织间基因组DNA甲基化水平相对稳定；（3）将‘上宋-14’核桃接穗分别嫁接到‘中宁奇’（‘上宋-14/中宁奇’）和‘宁优’（‘上宋-14/宁优’）砧木上，测定了3年生树体的树高、树径、冠幅、生长枝长、生长枝粗和发育枝长，不同砧木对树体生长具有显著影响。‘上宋-14/中宁奇’和‘上宋-14/宁优’树高平均值分别为5.33m和4.18m，‘上宋-14/中宁奇’明显优于‘上宋-14/宁优’，其它反应生长势的表型性状指标如树径、冠幅、生长枝长、生长枝粗和发育枝长，‘上宋-14/中宁奇’也明显高于‘上宋-14/宁优’（P<0.01，表4-2），表明‘中宁奇’和‘宁优’两种砧木对‘上宋-14’接穗的生长和发育具有显著影响；（4）采用Li-6400光合仪测量了分别嫁接在‘中宁奇’和‘宁优’砧木上的‘上宋-14’的光合特性。在相同立地条件和环境下，光合特性各项指标在两组砧穗组合上存在显著差异。‘上宋-14/中宁奇’最大净光合速率（21.52μmolm-2s-1）显著高于‘上宋-14/宁优’（19.96μmolm-2s-1），‘上宋-14/中宁奇’的光饱和点（LSP(B)）、光补偿点（LCP(C)）和暗呼吸速率（Rd(D)）指标（平均1191.6μmolm-2s-1、8.03μmolm-2s-1和0.52μmolm-2s-1）显著低于‘上宋-14/宁优’核桃树数值（平均1257.87μmolm-2s-1、9.8μmolm-2s-1和0.64μmolm-2s-1，P<0.05，图4-2）；（5）采用MSAP技术分析了嫁接到‘中宁奇’和‘宁优’砧木上的‘上宋-14’品种的新梢韧皮部组织全基因组DNA甲基化状态，共扩增出1607条清晰可辨的电泳谱带。‘上宋-14/中宁奇’组合的整体甲基化水平（25.39％）、CG全甲基化位点甲基化水平（17.67％）和CHG半甲基化位点甲基化水平（7.72％）虽然均略低于‘上宋-14/宁优’组合（分别为27.57％、18.73%和8.84%，表4-3），但差异不显著（Utotal=0.72，<1.96），甲基化模式变异频率在0.85-1.95%之间。因此，鉴定甲基化改变的特异位点，了解其生物学功能，成为更重要和实质性的研究。（6）对存在于两组砧穗组合的甲基化变异条带，进行克隆和测序，得到73条反应甲基化模式变异的变异条带序列，Blast分析表明，49.32%的条带序列与已知功能的蛋白编码基因具有同源性，12.33%的基因片段与光合作用相关基因同源，6.85%的片段序列与质体基因组序列同源，其余为假定蛋白编码基因（16.44%）和转座子/逆转座子（6.85%）同源序列，与NCBI数据库序列无明显相似性序列占20.55%。（7）本研究揭示出嫁接可以改变树体生理和代谢、影响树体生长，嫁接也会引起基因组DNA特异位点甲基化改变，而这些位点的基因序列又与树体生长和生理代谢密切相关。因此，砧木改变树体基因组甲基化模式可能是改变其生理和代谢进而影响生长发育的重要原因之一。
【作者】周贝贝；
【导师】裴东；
【作者基本信息】中国林业科学研究院，林木遗传育种，2014，博士
【关键词】核桃；嫁接；MSAP；表型性状；光合特性；表观遗传学；DNA甲基化；

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