eNOS基因转染对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

【摘要】第一部分eNOS重组腺病毒载体的制备目的：构建含有eNOS基因的重组腺病毒载体。方法：（1）将重组腺病毒载体Ad-eNOS行基因测序。（2）将重组腺病毒载体Ad-eNOS用脂质体介导转染293细胞包装成病毒颗粒，应用合成的eNOS基因引物行Real-timePCR鉴定。（3）通过测定吸光值计算病毒滴度并分装。结果：（1）经测序，Ad-eNOS基因序列与GeneBank中的eNOS序列一致，比对符合率100%。（2）Real-timePCR鉴定重组腺病毒Ad-eNOS包装成功。（3）经病毒滴度测定，Ad-eNOS滴度为9.35×109PFU/ml。结论：成功构建了重组腺病毒载体Ad-eNOS质粒，采用HEK293细胞进行腺病毒包装，最终获得重组腺病毒Ad-eNOS。第二部分eNOS基因转染对L02肝细胞缺复氧损伤的保护作用目的：探讨eNOS基因转染对L02肝细胞缺复氧损伤的保护作用。方法：采用L02肝细胞，放入低氧环境（含95%N2+5%CO2、PO2≤4Kpa）及复氧环境（85%O2+15%CO2，PO2≥13Kpa）孵箱中培养，建立缺复氧模型，实验分三组：实验组加入Ad-eNOS处理；对照组和正常组加RPMI-1640培养液。实验组和对照组放入缺复氧模型中培养，正常组在5%CO2、饱和湿度的孵箱内培养。检测培养液中ALT及NO的含量，Real-timePCR检测eNOS的基因表达，Western-blot检测eNOS的蛋白表达，流式细胞检测细胞凋亡。结果：实验组细胞培养液中ALT含量(26.26±3.78u/l)明显低于对照组(48.42±5.31u/l)（P﹤0.05）,但高于正常组(17.20±2.64u/l)，差别有显著意义（P﹤0.05）；而NO的含量实验组（18.89±3.30umol／L）明显高于对照组（6.44±2.11umol／L）和正常组（8.85±2.40umol／L）（P﹤0.05）；Real-timePCR及Western-blot结果显示实验组eNOS在基因及蛋白水平的表达均明显高于对照组及正常组（P﹤0.05）；流式细胞结果显示实验组L02肝细胞凋亡明显低于对照组（P﹤0.05），而正常组L02肝细胞凋亡很少。结论：（1）腺病毒载体成功将eNOS基因转染到L02肝细胞上，使其高表达eNOS基因及蛋白；（2）eNOS基因转染可减轻L02肝细胞缺复氧损伤的细胞凋亡；（3）eNOS基因转染可能通过升高NO途径对L02肝细胞缺复氧损伤有保护作用。第三部分大鼠小体积肝脏移植模型的建立目的：用改良二袖套法建立稳定的大鼠小体积肝脏移植模型。方法：在Kamada二袖套法的的基础上，对大鼠原位肝移植术在取肝、灌注、修植肝等手术操作以及围手术期的处理进行改良，建立稳定的大鼠原位肝移植模；在此基础上再建立稳定的大鼠小体积肝脏移植模型。结果：通过三阶段比较，正式实验组在手术时间、无肝期、手术成功率、并发症等方面均有明显提高。结论：（1）改良的二袖套法具有无肝期短、手术成功率高、大鼠术后存活时间长的优点，是大鼠原位肝移植的理想术式；（2）在建立稳定的大鼠原位肝移植模型的基础上开展大鼠小体积肝移植模型有利于提高模型的稳定性。第四部分eNOS基因转染对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤的保护作用目的：探讨eNOS基因转染对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。方法：SD大鼠12对，随机分两组（n=6）行小体积肝移植。对照组供体用空载体进行腹腔注射，实验组供体用Ad-eNOS进行腹腔注射。36小时后取肝行小体积肝移植。门静脉复流后6小时后处死模型，采血送检肝功能；硝酸还原法检测NO浓度；免疫组化检测TNF-α、巨噬细胞；TUNEL法检测肝组织的细胞凋亡；流式细胞检测肝细胞凋亡率；Real-timePCR检测肝脏组织的eNOS基因表达；Western-blot检测肝组织中的eNOS蛋白表达。结果：（1）实验组的ALT、AST、LDH显著低于对照组；细胞凋亡率显著低于对照组；（2）肝组织NO含量实验组明显高于对照组；（3）Real-timePCR及Western-blot结果显示实验组eNOS在基因及蛋白水平的表达均明显高于对照组；（4）免疫组化发现TNF-α及巨噬细胞在对照组中高表达，实验组中低表达。结论：eNOS在大鼠小体积肝移植缺血再灌注损害中对肝细胞有保护作用，其作用机制可能与下调TNF-α，抑制巨噬细胞浸润有关。
【作者】张伯；
【导师】钱海鑫；
【作者基本信息】苏州大学，普通外科学，2014，博士
【关键词】eNOS；腺病毒载体；缺血再灌注损伤；小体积肝移植；L02肝细胞；

【参考文献】
[1]丁朋,殷木一,张凌,刘富林.锂离子电池负极材料MnO的研究进展[J].化工新型材料,2014,05:16-17+25.
[2]邵新.上市公司要约收购法律制度研究[D].华东政法学院,法律,2004,硕士.
[3]陈凯,冯全源.最大频繁项集的高效挖掘[J].微电子学与计算机,2005,08:22-25.
[4]王斌,顾惠忠.内嵌于组织管理活动的管理会计:边界、信息特征及研究未来[J].会计研究,2014,01:13-20+94.
[5]陆文婷.我国建筑师专家责任研究[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[6]梁清.对蒙汉语谦语教学研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[7]付鸿晔.锻造操作机的运动学分析及整机设计[D].燕山大学,机械电子工程,2014,硕士.
[8]袁梦思.房地产企业逃避税手段及成因研究[D].北京交通大学,2014.
[9]孙星.基于PLC的J2108A型印刷机数字化改造研究[D].齐鲁工业大学,轻工技术与工程,2013,硕士.
[10]焦玉英,索传军,张学红.论图书馆专业信息服务频道及其实现方法[J].中国图书馆学报,2002,05:44-46.
[11]高晓健.基于支持向量机的高光谱遥感图像分类方法研究[D].杭州电子科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[12]王喆.我国上市公司并购创造价值的实证研究[D].大连理工大学,工商管理,2004,硕士.
[13]戴欣.山西省某医疗机构2008年—2011年药品不良反应综合分析[D].山西医科大学,药物化学,2013,硕士.
[14]张影.新洋茉莉醛生产废水预处理技术研究[D].合肥工业大学,环境工程,2014,硕士.
[15]孙艳燕.我国技术获取型对外直接投资的实证研究[D].浙江工业大学,2008.
[16]蒋伟进,唐代喜,刘青宝.面向主题的关系—多维数据模型建立与数据集市[J].微机发展,2003,06:74-76.
[17]孙辉,高礼.电站锅炉离心式送、吸风机和排粉机的节能潜力[J].华北电力技术,2004,02:43-47.
[18]王柯.江西省乒乓球竞技运动发展现状与对策研究[D].华东交通大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[19]夏文浩.卡夫卡短篇小说与情境[D].东北师范大学,文艺学,2012,硕士.
[20]王昵.余抗区女性性工作者艾滋病梅毒感染风险及社区综合干预研究[D].复旦大学,公共卫生,2012,硕士.
[21]蔡海静.我国政府信息公开制度论析[D].东北师范大学,马克思主义中国化研究,2012,硕士.
[22]牟海斌.榆溪河河床沉积物渗透系数空间变异性及河水与地下水转化关系研究[D].长安大学,地下水科学与工程,2014,硕士.
[23]宋超.臭氧发生设备故障分析及诊断方法的研究[D].大连理工大学,电工理论与新技术,2013,硕士.
[24]梁金福.超声场中气泡动力学及其线光谱的辐射[D].南京大学,声学（专业学位）,2014,博士.
[25]孙昭友.能遏止产生二噁英的包装塑料薄膜[J].包装世界.2000(05)
[26]张微.后现代主义对大学生思想政治教育的影响及对策[D].河北师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[27]吴鹏.基于本体面向服务架构的构件检索技术研究与实现[D].太原科技大学,计算机技术,2013,硕士.
[28]张春贺,乔德武,李世臻,张敏,甘贵元,许勇,唐怡.柴达木盆地西部复杂山地宽线地震勘探技术[J].石油地球物理勘探,2012,02:189-193+179.
[29]戴欣.乳腺癌组织中PIK3CA、KRAS及BRAF基因突变热点区域的序列分析[D].淮北师范大学,植物学,2014,硕士.
[30]程小霞.聚乳酸基支架制备及其纳米拓扑结构与细胞相互作用研究[D].华侨大学,生物化工,2014,硕士.
[31]尤春艳.在中国餐饮文化影响下的西餐厅设计[D].河北科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[32]黄超,龚惠群,张华锋.POS系统中具有确定性时间约束的交易规则挖掘[J].计算机工程,2002,05:108-110.
[33]齐彬,张文忠.国内高校英语教学中思辨性阅读能力培养研究20年述评(1994-2013)[J].高等教育研究学报,2014,01:90-95.
[34]曹杨.对美国财政部2001-2012年《国际经济与汇率政策报告》中意识形态的批评性研究[D].广东外语外贸大学,商务英语研究,2013,硕士.
[35]安新磊.大学生群体移动智能终端第三方应用使用行为的实证研究[D].北京邮电大学,企业管理,2013,硕士.
[36]刘斌.休闲类网络游戏客户生命周期不同阶段忠诚影响因素实证研究[D].浙江大学,2007.
[37]宗永艳.贵阳市高中数学新教师与经验型教师的MPCK的比较研究[D].贵州师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[38]徐静,孙潇静.基于我国企业的CRM系统的体系框架研究[J].价值工程,2005,01:86-87.
[39]茹耀华.同煤集团人事管理系统的设计与开发[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[40]祝文亮,刘俊杰,梁峰,陈树亮.三维叠前深度偏移技术在千米桥潜山勘探中的应用与效果[J].石油地球物理勘探,2001,01:86-92+133.
[41]孙恒超,陈国定,王莉娜,王菲.轴承腔油滴含率及油滴相与空气能量传递分析[J].航空学报.
[42]李大字,焦军胜,靳其兵,高彦臣.基于输出方差限制的广义多变量控制系统性能评价[J].自动化学报,2013,05:654-658.
[43]张敏.统一战线是中国现代化建设的法宝[J].江苏政协.2008(05)
[44]伍锋.丹红注射液联合脂肪干细胞移植改善糖尿病裸鼠后肢缺血血管新生的研究[D].第二军医大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[45]尚利晓.玻璃体腔注射卡介菌纯蛋白衍生物诱导Eales病动物模型的研究[D].遵义医学院,眼科学（专业学位）,2012,硕士.
[46]张涛,洪文学.基于模糊度的计算几何分类器权重分配[J].控制与决策,2013,04:569-573.
[47]吕松泽.中国企业实施CRM状况的分析[J].学术交流,2005,08:87-89.
[48]李露露.论奥古斯都·威尔逊戏剧中的分离与回归[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[49]周立阳.多核处理器的任务映射与通信路由算法研究[D].复旦大学,集成电路工程,2012,硕士.
[50]高茜.黄土沿第三纪不整合面滑坡机理及防治措施[D].长安大学,防灾减灾工程及防护工程,2014,硕士.