“益肾调督”法对AD模型大鼠神经元轴突线粒体损伤的影响及针灸作用机制研究

【摘要】目的：以线粒体损伤机制为中心，从线粒体超微结构、线粒体损伤三大途径（线粒体能量代谢障碍途径、线粒体动力学异常途径和线粒体通透性转换孔mPTP孔开放途径）出发，综合系统地探讨线粒体损伤机制与阿尔茨海默病发病机制之间可能存在的相关性及“益肾调督”针灸法防治AD过程中在线粒体损伤方面的可能作用机制。方法：Wistar大鼠，SPF级、雄性、体重200±20g，80只，实验前所有大鼠置于鼠笼常规适应性喂养一周；实验时，经Morris水迷宫测试筛选，剔除先天性不符合评定标准的大鼠（定位航行试验中平均逃避潜伏期较长，空间探索实验中的跨越原平台次数较少和有效区停留时间较短者评定为不合格者，予以剔除，补充相应合格者）；通过《卫生统计学》随机数字表法将80只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和针灸治疗组，每组20只，分笼饲养，并用苦味酸给予染色标记编号；采用双侧海马区（前囟后3.3mm，中线左右各旁开1.5mm，深度3mm）分别注射Aβ1-42（各5μL）的模型复制方法和Morris水迷宫模型评定方法（剔除不符合评定标准者，并补充相应合格者），其中正常组、假手术组（除注射等量（双侧各5μL）的生理盐水外，其余同模型组处理方法）和模型组均进行相应处理后，正常饲养，不进行任何其它处理；针灸治疗组在模型复制成功后（已通过模型评价），先针刺“百会”穴（向前平刺3～5mm），双侧“肾俞”穴（稍向内斜刺5mm）后，选用特制艾条（Φ=0.6cm）于“百会”和“肾俞”穴位上方2～3cm处进行悬灸，使穴位表皮温度在43±1℃，持续15min，每日1次，7天为一个疗程，共计2个疗程，疗程间休息1日；运用透射电镜、免疫组化、免疫荧光、免疫印迹、RT-PCR等技术，通过观察各组大鼠海马神经元线粒体超微结构、线粒体能量代谢相关蛋白Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白ABAD与细胞色素氧化酶Ⅳ（COXⅣ）、线粒体动力学相关蛋白线粒体分裂蛋白1（Fis1）与内膜视神经萎缩1蛋白（Opa1）、线粒体通透性转换孔相关蛋白亲环蛋白D（CypD）等指标的变化，探讨“益肾调督”针灸法对线粒体损伤三大途径的影响。整个实验过程严格遵守国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。结果：（1）“实验一”结果显示，模型组大鼠毛发光泽度降低，部分可见脱毛伴行动迟缓，进食饮水量有所减少，对外界刺激反应降低；透射电镜观察其海马CA1区神经元线粒体，可见线粒体形态呈卵圆形，但其数目较少，且分布不均，内嵴大部分排列紊乱，部分可见内嵴溶解消失，基质疏松，线粒体肿胀明显且部分空泡变性；周边内质网扩张，与正常组和假手术组具有明显的差异；而针灸治疗组大鼠皮毛尚有光泽，进食饮水量正常，对外界刺激反应尚可；透射电镜观察可见线粒体形态呈卵圆形，数目尚可，且分布均匀，内嵴尚清晰且排列较整齐，少数可见嵴内腔轻微扩张及内嵴轻度溶解，基质尚均匀，未见线粒体肿胀及空泡变性；周边内质网轻度扩张，总体较模型组有所改善。（2）“实验二”结果显示，模型组大鼠海马神经元线粒体中ABAD的含量明显高于正常组和假手术组（P<0.01），COXⅣ的水平明显低于正常组和假手术组（P<0.01）；而针灸治疗组海马神经元线粒体中的ABAD的水平明显低于模型组（P<0.01），而COXⅣ的活性明显高于模型组（P<0.01），且与正常组和假手术组之间无明显的差异（P>0.05），提示“益肾调督”针灸法具有抑制ABAD的过表达，提高COXⅣ活性的作用；（3）“实验三”结果显示，模型组大鼠海马神经元线粒体融合相关蛋白Opa1的水平明显低于正常组和假手术组（P<0.01），线粒体分裂相关蛋白Fis1的水平明显高于正常组和假手术组（P<0.01）；而针灸治疗组海马神经元线粒体中Opa1的水平明显高于模型组（P<0.01），Fis1的水平明显低于模型组（P<0.01），且与正常组和假手术组比较无统计学意义（P>0.05），提示“益肾调督”针灸法具有抑制Fis1的过表达，上调Opa1水平的作用；（4）“实验四”结果显示，模型组大鼠海马神经元线粒体中CypD的表达明显高于正常组和假手术组（P<0.01）；而针灸治疗组可明显抑制大鼠海马神经元线粒体中CypD的过表达，与模型组比较具有明显的差异（P<0.01），提示“益肾调督”针灸法具有下调CypD含量的作用。结论：（1）“益肾调督”针灸法不仅整体上能够改善AD发病过程中的行为学变化，而且还能够在一定程度上改善AD发病过程中海马神经元线粒体超微结构的损伤；（2）“益肾调督”针灸法能够通过抑制Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白ABAD的过表达，有效地提高细胞色素氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性，达到改善线粒体能量代谢的目的；（3）“益肾调督”针灸法能够有效地抑制线粒体分裂蛋白Fis1的过表达，提高线粒体融合蛋白Opa1的水平，从而调节线粒体分裂与融合的平衡，达到改善线粒体动力学异常的目的；（4）“益肾调督”针灸法能够有效地抑制线粒体通透性转换孔mPTP的必需成分之一，即亲环蛋白酶D（CypD）的过表达，从而抑制线粒体通透性转换孔的异常开放，达到改善线粒体膜内外渗透失衡的目的。因此，海马神经元线粒体损伤与阿尔茨海默病发病机制之间具有密切的相关性，且“益肾调督”针灸法可能通过改善海马神经元线粒体超微结构的病理改变及调节线粒体损伤三大途径的异常，进而改善线粒体损伤，达到防治AD的目的。
【作者】罗磊；
【导师】孙国杰；
【作者基本信息】湖北中医药大学，针灸推拿学，2014，博士
【关键词】“益肾调督”；针刺加灸；AD模型大鼠；线粒体损伤三大途径；

【参考文献】
[1]廖晓苏.未成年人监护制度的不足与完善[D].华侨大学,民商法学,2013,硕士.
[2]梁忠超,高海波,刘振,丁亮,邓宗全,曲建俊.载人月球车等效侧倾刚度和阻尼计算方法[J].机械工程学报.
[3]张梅胤.“正常”与“非正常”之辩[D].复旦大学,人类学,2012,硕士.
[4]周雨.肠缺血—再灌注导致新生鼠仔肝损伤及其机制的初步研究[D].大理学院,儿科学,2013,硕士.
[5]王一.图像编辑关键算法研究[D].北京交通大学,人机交互工程,2012,硕士.
[6]陈龙.互联网安全管理模式的重构：虚拟社区警务研究[D].浙江大学,行政管理,2003,硕士.
[7]秦洁茹.中学教师教学反思现状的调查与分析[D].山西师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[8]高超杰.关于思想政治教育学科界定的理论思考[D].中南大学,马克思主义理论,2014,博士.
[9]胡继刚.非傍轴衍射理论的研究及其应用[D].合肥工业大学,课程与教学论,2004,硕士.
[10]钟海旺,夏清,丁茂生,张慧玲.以直流联络线运行方式优化提升新能源消纳能力的新模式[J].电力系统自动化,2015,03:36-42.
[11]付正鑫.基于广域测量技术戴维南等值参数的计算及在电压稳定性分析中的应用[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[12]姬颖超.高职院校学生职业精神培养探析[D].河北师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[13]于仲山.探讨以人为中心的企业管理[J].发电设备.1989(11)
[14]李倩倩.不同品种威灵仙药材的质量控制研究[D].北京中医药大学,药物分析学,2013,硕士.
[15]王学谦.部分地区农村小学“跑完全程”体育公益项目可实施性研究[D].首都体育学院,体育教学,2013,硕士.
[16]张俊洁.新型吸附材料处理矿井水中Fe~(2+)、Mn~(2+)的试验研究[D].辽宁工程技术大学,市政工程,2012,硕士.
[17]江洁.我国遗嘱信托制度的构建[D].浙江大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[18]毕媛媛.性别视角下严歌苓小说的电影改编[D].厦门大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[19]欧阳翎.广西黑衣壮族村落与建筑研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[20]姚玲.沈从文乡土小说与湘西民歌的关系研究[D].华中师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[21]王玲.基于人工神经网络的水文过程模拟研究[D].河海大学,2002.
[22]郭海亭.山东省艺术体育学生教学满意度研究[D].山东体育学院,体育教学,2012,硕士.
[23]张亚楠.城市社区建设中的法制教育问题研究[D].内蒙古科技大学,思想政治教育,2014,硕士.
[24]徐雅俊.压缩传感语音编码算法[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2010,硕士.
[25]李树春.温血停搏液间断灌注在心脏瓣膜替换术中的心肌保护作用[D].第四军医大学,外科学,2004,硕士.
[26]白利娜,赵凌云.时间域属性组合法提取品质因子Q[J].石油地球物理勘探,2015,03:436-443+2-3.
[27]刘海涛.生物纳米净水材料制备与应用[D].吉林大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[28]缪昌冬.大型落地镗铣床主轴箱液压系统的设计与研究[D].东北大学,机械电子工程,2011,硕士.
[29]魏春敏.CYP2E1酶在去甲斑蝥素代谢和环孢素诱导肝损伤中的作用研究[D].山东大学,药理学,2014,博士.
[30]邵灿辉,刘振兴,罗铭,曾志伟.低损耗三调谐滤波器的设计与应用[J].冶金自动化,2008,06:51-54.
[31]张晓东.卷烟配送中心物流绩效动态评价模型研究[D].山东大学,物流工程,2013,硕士.
[32]陈洪茂.肝癌缺血再灌注损伤的基础研究[D].第四军医大学,动物学,2004,硕士.
[33]曾碧１,２,毛勤１,２.改进的室内三维模糊位置指纹定位算法[J].山东大学学报(工学版).
[34]孟琛.孟子、荀子人性论的比较[D].吉林大学,中国哲学,2013,硕士.
[35]胥传普,杨立兵,刘福斌.关于节能降耗与电力市场联合实施方案的探讨[J].电力系统自动化,2007,23:99-103.
[36]崔艳娟.我国国际物流业的发展及对策研究[D].吉林大学,国际贸易学,2004,硕士.
[37]库梅.政治新闻语篇的批评性分析[D].广东外语外贸大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[38]张鑫.喷淋头高度对MOCVD生长GaN外延层质量的影响[D].大连理工大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[39]翟晓东.RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达及意义[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[40]HansKuzmany.第25届国际冬季讲习班在基希贝格/蒂罗尔,奥地利——回顾过去,展望未来[J].化学通报,2011,05:479-480.
[41]欧阳静娥.起源于房间隔及邻近区域局灶性房性心动过速的电生理特点和射频导管消融[D].第四军医大学,内科学,2014,硕士.
[42]赵旸.大同市暑期少年儿童游泳培训班生存教育内容的现状调查研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[43]熊琦.合并创伤性脑损伤的四肢骨折小鼠血清对破骨细胞分化影响的研究[D].中国人民解放军医学院,外科学,2013,硕士.
[44]刘磊.椭圆曲线密码体制在SET协议中的应用与软件实现[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[45]徐为.以工程大肠杆菌为模型探究不同修饰剂对纳米粒子生理毒性的影响[D].华中农业大学,应用化学,2014,硕士.
[46]张鉴.纳米电子技术的发展与展望研究[J].中外企业家,2013,02:125.
[47]丁灵.论《万叶集》所见从格表现[D].浙江工商大学,日语语言文学,2012,硕士.
[48]于怀石.左家山下层文化研究[D].吉林大学,考古及博物馆,2013,硕士.
[49]蒋梦捷.六自由度Stewart平台的设计及在光学检测中应用的研究[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,机械工程,2012,硕士.
[50]李德元,王　洋,万仁毅,王　栋.激光加工弹体材料５０ＳｉＭｎＶＢ脆性带的对比[J].沈阳工业大学学报.