艾灸对Alzheimer病模型大鼠JNK信号通路及细胞凋亡相关因子影响的研究

【摘要】目的阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)，俗称老年性痴呆，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，是老年人脑功能退化的一种表现，以进行性、不可逆性出现智能减退为主要临床特征，包括近期记忆、思维、认知、定向、理解、计算、判断能力等功能的减退和不同程度的人格异常改变。随着全球人口老龄化的加重，AD已经成为人类继心脏病、癌症和脑卒中之后第4位致死原因。AD患者晚期劳动能力丧失，生活不能自理，心理适应能力亦急剧下降，给家庭和社会造成沉重治疗负担。本课题采用双侧海马一次性注射聚集态Aβ25-35造成AD大鼠模型，运用艾条温和灸“肾俞”、“足三里”、“百会”进行治疗，从JNK信号通路介导的细胞凋亡反应的角度探讨AD模型大鼠脑内神经元损伤机制及艾灸干预的作用机制。方法健康雄性SD大鼠（15月龄）50只，体重(400±50)g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。提前1周将大鼠运到实验室适应性喂养，安静清洁环境下定时给以饮水及饲料。然后进行Y型水迷宫筛选，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，将合格大鼠按随机数字表法分为4组，每组10只，分别为正常组、假手术组、模型组、艾灸组。采用双侧海马一次性注射聚集态Aβ25-35造成AD大鼠模型，造模完成后第2日开始进行艾灸治疗，在大鼠“肾俞”、“足三里”、“百会”穴上方2～3cm处温和灸。每日治疗1次，每穴持续艾灸5min，6日为1疗程，疗程间休息1日，共3个疗程。Morris水迷宫法测定其学习记忆能力的行为学变化，HE染色及透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞结构的形态学变化，免疫组化SP法观察艾灸对AD模型大鼠海马区磷酸化JNK蛋白(p-JNK)、神经细胞凋亡的关键调控因子Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。全部数据输入计算机，用SPSS16.0统计软件包进行处理，所得数据以均数±标准差（xs）表示。结果（1）Morris水迷宫行为学试验发现，各组大鼠逃避潜伏期随着游泳天数的增加而逐渐缩短，但各组之间表现出的学习记忆能力有很大差异。大鼠双侧海马一次性注射Aβ25-35聚集液后，定位航行试验中，模型组大鼠5天平均潜伏期及后3天平均潜伏期均较其他组明显延长，大鼠在实验平台象限的游泳距离占游泳总距离百分比(象限百分比)明显减少；空间探索试验中，模型组大鼠跨越原平台位置的次数比其他各组明显减少，大鼠在实验平台象限的游泳距离占游泳总距离百分比(象限百分比)亦明显减少，与正常组及假手术组比较，有显著性差异(P<0.01)。说明模型组大鼠学习记忆能力受到严重损害，双侧海马一次性注射Aβ25-35制备AD模型成功。对AD大鼠采用艾灸治疗后，定位航行试验中，大鼠5天平均潜伏期和后3天平均潜伏期均明显缩短；空间探索试验中，大鼠跨越原平台位置的次数明显增多；在实验平台象限的游泳距离占游泳总距离百分比(象限百分比)明显增高，与模型组比较，经统计学分析，有显著性差异(P<0.01)。说明艾灸对AD模型大鼠的学习记忆功能具有明显改善作用，艾灸疗法是治疗学习认知功能障碍的有效方法之一，可广泛运用于临床。（2）HE染色观察结果显示，模型组大鼠海马CA1区神经细胞数量较正常组和假手术组明显减少，神经细胞受损缺失，细胞核固缩，核仁欠清晰，部分神经细胞呈现出月牙型、多齿形等凋亡形态。运用艾条温和灸“肾俞”、“足三里”、“百会”治疗后，大鼠海马CA1区神经细胞核固缩现象明显改善，形态较规则，排列较整齐。透射电镜观察结果显示，Aβ在大鼠脑内能引起海马CA1区神经细胞的退行性改变，神经元体积缩小，细胞核形态不规则，细胞浆和细胞器密度增高，细胞器结构受损，显示不清，线粒体肿胀，基质清淡、有空泡，数目减少，还可见到线粒体嵴呈畸形样改变，内质网扩张，脂褐素沉积增多。运用艾灸治疗后，大鼠海马CA1区神经细胞水肿较模型组明显减轻，内质网扩张及线粒体肿胀明显改善，高尔基体、线粒体、核糖体数目较模型组明显增多。表明艾灸治疗可抑制注射Aβ导致的大鼠海马区神经细胞损伤变性，促进神经细胞的修复，艾灸对AD模型大鼠海马神经细胞的退行性改变有明显改善作用。（3）模型组大鼠海马区p-JNK、Bax、Caspase-3阳性神经元计数较正常组、假手术组显著升高，Bcl-2阳性神经元计数则较正常组、假手术组显著降低，经统计学分析，均具有显著性差异（P<0.01）；艾灸组大鼠海马区p-JNK、Bax、Caspase-3较模型组表达明显下降，Bcl-2阳性神经元计数则较模型组明显升高，经统计学分析，均具有显著性差异（P<0.01）。结论（1）海马区注射Aβ25-35可以激活JNK信号转导途径，JNK的激活导致促凋亡蛋白Bax释放增多，抗凋亡蛋白Bcl-2释放减少，引起了Caspase级联反应，进而活化细胞凋亡的关键蛋白酶Caspase-3，启动了依赖Caspase通路的凋亡程序，从而诱导AD大鼠脑内神经元的退行性改变，引起大鼠学习记忆障碍。（2）艾灸治疗可引起p-JNK、Bax、Caspase-3在大鼠海马区的表达明显减少，Bcl-2的表达明显增多，可抑制注射Aβ导致的大鼠海马区神经细胞损伤变性，促进神经细胞的修复，艾灸对AD模型大鼠海马神经细胞的退行性改变有明显改善作用。（3）艾灸治疗AD的作用机制，可能是通过抑制JNK信号通路，减轻促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的释放,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的产生，从而抑制脑内神经细胞的凋亡,减少神经元的变性丢失，进而改善Aβ所致的大鼠学习记忆障碍。
【作者】万博鹏；
【导师】孙国杰；
【作者基本信息】湖北中医药大学，针灸推拿学，2014，博士
【关键词】阿尔茨海默病；艾灸；c-jun氨基末端激酶；Bcl-2；Caspase-3；

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