拟南芥AtNRGA1与AtGPK1参与植物干旱胁迫响应的机理研究

【摘要】干旱可以对植物造成严重不可逆的伤害,影响植物生长发育以及作物产量。随着气候环境变化,干旱已经是当今世界所面临的全球性问题,严重影响农业生产和粮食安全。植物根系所吸收的绝大部分水分,被气孔以蒸腾作用散失,因此,揭示植物气孔运动的调控机理及信号转导网络,发掘参与植物干旱胁迫响应的功能基因并明确其作用机理,将为提高植物水分利用效率,发展高产耐旱农业提供理论指导和功能基因。本论文以模式植物拟南芥为材料,以在保卫细胞中大量表达的蛋白编码基因的功能缺失突变体为研究对象,进行干旱胁迫筛选,获得了两个参与植物干旱胁迫响应的关键功能基因,分别命名为,AtNRGAl(ArabidopsisNegativeRegulatorofGuardcellABAsignaling)和AtGPK1(ArabidopsisGuardcellProteinKinase1)。采用遗传学、分子生物学、生理性状实验、电生理学、酵母双杂交等技术,对这两个基因调控气孔运动与植物抗旱性的功能进行了分子机理研究与分析。1,AtNRGAl参与气孔运动与植物抗旱性的功能研究与机理分析前期蛋白质组学、Promoter+GUS染色结果及不同组织的反转录结果均表明,NRGAl在保卫细胞大量表达。NRGAl的T-DNA插入功能缺失突变体nrgal,在干旱环境中的存活率高于Col-0；进一步的离体叶片失水实验也证明,nrgal的失水率低于野生型对照。ABA是重要的植物干旱胁迫响应激素,并参与了植物的气孔运动的调控。因此,nrgal的耐干旱性状可能与ABA调控气孔运动的过程相关。利用气孔运动实验证明,nrgal对ABA诱导的气孔关闭及ABA抑制光诱导的气孔开放均较野生型过敏感。保卫细胞电生理结果显示,nrgal的内向钾离子通道(Kin+)及慢速阴离子通道对ABA的敏感性高于野生型。为进一步证明NRGAl的功能缺失是nrgal各生理性状差异的原因,构建并筛选获得NRGAl过表达株系(NRGAl-OE-5.NRGA1-OE-7)和nrgαl/NRGAl功能恢复株系(NRGAl-C-1、NRGAl-C-7)。nrgαl/NRGA1功能恢复株系,逆转了突变体对ABA过敏感的性状。气孔运动试验表明,过表达株系表现和突变体相反的性状,对ABA的作用变得弱敏感,相同ABA浓度处理下,过表达株系的气孔开度大于野生型和空载体对照(EV1),而且过表达株系的离子通道活性对ABA的作用也变得弱敏感。过表达株系的离体叶片失水速率大于空载体对照(EV1),且植株的抗旱能力降低,其存活率明显低于空载体对照。这些研究结果表明,NRGAl是ABA响应的负调控因子,参与保卫细胞离子通道的活性及气孔运动的调控,并进而介导了植物的干旱胁迫响应。生物信息学分析表明,NRGAl具有保守的结构域-UPF0041,与预测的丙酮酸转运体2(MPC2)具有相似的氨基酸序列,本研究通过酵母突变体功能互补的方法,证明NRGAl具有丙酮酸转运体的功能。另外,NRGAl的亚细胞定位研究结果证明,其定位于线粒体,这一定位也与之可能的生理功能相对应。以上结果表明,NRGAl在植物体内可能具有丙酮酸转运体的功能,而且作为ABA负调控因子,影响保卫细胞跨膜离子转运及气孔运动,进而引起植物对干旱胁迫做出响应。2,AtGPK1参与气孔运动与植物抗旱性的功能研究与机理分析前期的蛋白组学、GUS染色及反转录结果均表明,GPK1在保卫细胞大量表达。本研究发现GPKl两个T-DNA插入功能缺失突变体,gpk1-1和gpk1-2,具有比野生型植株更加耐干旱的性状,并对GPK1参与植物干旱胁迫响应的分子机理进行了探讨。实验结果显示,GPK1作为一个负调控因子参与ABA调控保卫细胞离子通道活性、气孔运动,进而参与植物干旱胁迫响应。离体叶片实验显示gpk1-1和gpk1-2的叶片失水率降低；同时突变体对ABA调控保卫细胞离子通道或气孔运动的过程过敏感。而且这种过敏感在功能恢复株系gpk1-1/GPK1(GPKl-C-1、GPK1-C-4)获得恢复。进一步结果显示,GPK1过表达株系(GPK1-OE-1、GPK1-OE-2)在气孔运动、离体叶片失水、离子通道活性实验中,都表现和突变体相反的性状,对ABA的作用变得弱敏感。亚细胞定位的研究表明GPK1蛋白定位于细胞质膜上。序列结构分析表明,GPK1属于CDPK(Ca2+DependentProteinKinase)钙离子依赖蛋白激酶家族成员。放射性同位素32P标记,原核表达并纯化的GPK1进行激酶活性分析发现,当钙离子存在时,GPK1具有自磷酸化活性,当去除钙离子后,激酶活性消失,从而从生化水平上证明GPK1是一个有功能的钙离子依赖蛋白激酶。为深入研究GPK1负调控植物气孔运动及离子通道的作用机制,我们利用酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,并获得了GPK1的相互作用蛋白GIP1(GPK1InteractingProtein1)。GIP1蛋白定位于内膜系统中,当与GPK1共转染拟南芥原生质体时,两个蛋白共定位在质膜上。体外生化实验证明,GIP1可以抑制GPK1的激酶活性,且抑制随着GIP1的浓度升高而加剧。进一步的气孔运动实验证明,GIP1过表达株系(GIP1-OE-8、GIP1-OE-14)对ABA过敏感,与GPK1突变体的性状一致。推测GIP1可能通过结合GPK1并抑制其激酶活性进而参与ABA保卫细胞信号通路。以上结果表明,GPK1属于植物CDPK家族成员,作为ABA信号通路的负调控元件,参与植物保卫细胞离子通道活性、气孔运动调控过程,并参与植物的干旱胁迫响应。在分子水平上,GPK1的激酶活性受Ca2+结合激活,并被其互作蛋白GIP1结合抑制。
【作者】李春龙；
【导师】张伟；
【作者基本信息】山东大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】气孔；保卫细胞；离子通道；脱落酸；干旱；

【参考文献】
[1]胡艳丽.陕西基督教差会社会事工研究（1876-1952）[D].西北大学,专门史,2013,硕士.
[2]何建斌.心脏手术围术期血糖波动增加急性肾损伤的发生及阿司匹林的保护作用[D].第四军医大学,麻醉学（专业学位）,2014,硕士.
[3]刘婕妤.胰高血糖素肽-1通过抑制内质网应激保护糖尿病心肌病大鼠心脏[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[4]卢孟康.开放植骨结合负压封闭引流技术（VSD）治疗创伤后感染性骨缺损的临床疗效[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[5]郑晨.产品介绍类文本翻译技巧探析[D].上海外国语大学,翻译,2014,硕士.
[6]肖亮琼.古典园林中的传统哲学研究[D].安徽农业大学,园林植物与观赏园艺,2012,硕士.
[7]盛菊华.合成树脂装饰板的阻燃处理及性能研究[D].南京林业大学,木材科学与技术,2004,硕士.
[8]丁玮.基于无线ZigBee网络的隧道监测系统设计[D].长安大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[9]李文琛.无线Mesh网络的DSR协议的分析与研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[10]李滢.慢性乙型肝炎病毒感染病毒复制与肝细胞内质网应激反应相关性的初步探讨[D].遵义医学院,传染病学,2013,硕士.
[11]陈晓姣.细胞传感器的构建及其在细胞表面糖表达分析中的应用[D].湖南师范大学,分析化学,2014,硕士.
[12]冯秀芳,吕淑芳.基于RSSI和分步粒子群算法的无线传感器网络定位算法[J].控制与决策,2014,11:1966-1972.
[13]艾欣.人脸检测算法研究[D].浙江大学,检测技术与自动化装置,2004,硕士.
[14]范宏令.AVS+编码平台网络管理系统[D].北方工业大学,电路与系统,2014,硕士.
[15]张辉,张浩,陆剑峰.SVM在数据挖掘中的应用[J].计算机工程,2004,06:7-8+24.
[16]魏春敏.CYP2E1酶在去甲斑蝥素代谢和环孢素诱导肝损伤中的作用研究[D].山东大学,药理学,2014,博士.
[17]韩旭.《奥多芙的神秘》的空间研究[D].山西师范大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[18]王燕.我国建筑业生态现代化发展模式与评价研究[D].大连理工大学,2008.
[19]樊朝飞.现代营销模式下的西安汽车专卖店建筑空间形态研究[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[20]韩冠.基于多媒体的在线协作学习系统[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[21]彭青松.Bayesian网及其在图像分析中的应用研究[D].合肥工业大学,2005.
[22]易萍.留学生话语标记使用情况考察与偏误分析[D].华中师范大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[23]张晓霞.4-5岁幼儿积木建构水平的提升及其对几何空间能力发展的影响[D].首都师范大学,学前教育,2013,硕士.
[24]张瑞刚.危岩突发性破坏机制研究[D].重庆交通大学,水工结构工程,2012,硕士.
[25]刘虎.单级光伏并网发电系统关键技术研究[D].兰州理工大学,电气工程,2013,硕士.
[26]赵秀清.人力资源生态与人力资源投资风险[D].山西大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[27]李武全,井元伟,张嗣瀛.一类高阶随机非线性系统的状态反馈镇定[J].控制与决策,2011,03:439-442+447.
[28]聂皓.22例颈动脉体瘤的诊断与治疗的回顾性分析[D].华中科技大学,血管外科,2013,硕士.
[29]王海波.Sr_2CuO_(3+δ)高温超导样品中微结构的同步辐射研究[D].中国科学技术大学,同步辐射及应用,2014,博士.
[30]陈嘉宁,黄民翔,刘子秋,钟宇峰,羌丁健.永磁直驱潮流能发电系统的建模及仿真[J].华东电力,2014,02:418-423.
[31]李伟伟,易平涛,郭亚军.混合评价信息的随机转化方法和应用[J].控制与决策,2014,04:753-758.
[32]尹靖元,金新民,吴学智,谢路耀,杨捷.兆瓦级直驱型风力发电系统的效率优化分析[J].北京交通大学学报,2014,02:74-79.
[33]张爽.鸦葱中黄酮成分HPLC指纹图谱的研究[D].吉林大学,药物化学,2014,硕士.
[34]张宜.综合布线系统发展趋势[J].智能建筑与城市信息.2004(01)
[35]王丹.香港家族剧女性形象探析[D].东北师范大学,广播电视艺术学,2012,硕士.
[36]梁月花.Th-U燃料循环中形变核能级密度的研究[D].广西师范大学,理论物理,2013,硕士.
[37]官礼和.面向法律领域案例归类判决系统的研究与实践[D].重庆交通学院,2004.
[38]薛亚茹,唐欢欢,陈小宏.高阶高分辨率Radon变换地震数据重建方法[J].石油地球物理勘探,2014,01:95-100+131+303.
[39]李旭光.四川江津四面山常绿阔叶林永久样地的非线性排序[J].植物生态学报,1995,03:286-292.
[40]王鹏.三四十年代中国现代派小说的时间叙事[D].辽宁大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[41]程诚.离子液体在BTCA免烫整理中的应用研究[D].东华大学,纺织工程（专业学位）,2014,硕士.
[42]胡灿.课改前后高中语文文言文课后习题研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[43]王晓伟.中国民间艺术人物造型在纤维壁挂中的研究与运用[D].西南交通大学,艺术设计（专业学位）,2013,硕士.
[44]黄亚男.避风港规则及其适用研究[D].河北经贸大学,法律,2014,硕士.
[45]尤丁力.行业特色型大学人才培养特色研究[D].西南交通大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[46]刘斌斌.两类非线性算子的不动点与固有值问题[D].江西师范大学,应用数学,2004,硕士.
[47]于光源.依兰—伊通断裂（吉林省段）活动性研究[D].吉林大学,地质工程,2013,硕士.
[48]赵晔炜.基于智慧城市视角下的广州市公共安全应急管理研究[D].华南理工大学,行政管理,2014,硕士.
[49]郑阳.城市视线通廊控制方法研究[D].长安大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[50]王玉红,宋瑞峰,江璠.工科普通化学教学中渗透化学前沿知识的探讨[J].科教文汇(上旬刊),2012,07:100-101.