氨基酸的衍生化研究

第一章绪论
中医药是中华民族的瑰宝，几千年来，在人类防治疾病方面做出了巨大贡献，现在仍然是我国医疗体系的重要组成部分。中医药在防治常见病、多发病、重大疑难疾病、传染病以及应对突发公共卫生事件等方面发挥了重要作用。中药是中医临床用药的形式，中药中所含的成分是中药发挥临床疗效的物质基础。中药化学成分研究是阐明中药药理作用、作用机制与物质基础的前提，也是改进中药制剂工艺、制定中药及其制剂质量标准、阐明中药炮制机理的重要基础，是中药现代化的重要组成部分。

1.1中药化学成分研究进展
1.1.1中药化学成分研究概况
中药除少数品种如青黨、冰片、阿胶等为人工制品外，大都是来自于植物、动物、矿物的非人工制品，并以植物来源为主且种类繁多。中药化学成分极其复杂，每味中药都含有多类化学成分，而其所组成的复方化学成分更多更复杂。中药有效成分的研究起源于20世纪20年代，我国学者陈克恢成功地从中药麻黄中提取出麻黄碱，并证明麻黄碱具有拟肾上腺素的作用，解释了麻黄平喻功效的药理作用、作用机制与物质基础。相继被研究的有延胡索、钩藤、膽酥、贝母、黄花夹竹桃等，并且取得了一定成绩，如从延胡索中分离出具有镇痛作用的延胡索乙素等多种生物碱；20世纪70年代以来，中药化学研究发展更加迅速，也取得了一定进展。如对青蒿、海南粗榧、天麻、唐古特山莨蓉、丹参、葛根、三尖杉、芫花根、天花粉、川弯、黄苗、当归、人参、五味子、甘草、冬虫夏草、灵芝、党参、青黛等多种中药化学成分的研究。据统计，我国医药学和化学科技工作者在20世纪80年代从中药总共发现800余个新化合物，20世纪90年代以后则每年有数百个新化合物被发现[1]。中药化学成分研究得到较大发展，取得了许多成绩。确定中药化学成分种类丰富，覆盖醌类、苯丙素类、香豆素、木脂素、黄酮、蔽类、挥发油、阜苷、留体、生物碱、苷类、驟质、有机酸、油脂、蜡、糖类、氨基酸、蛋白质、酶、色素、维生素、树脂、无机盐和微量元素等。

1.1.2中药化学成分提取、分离与鉴定技术
对中药化学成分的研究，即釆用适宜的方法从中药中提取分离，并进行结构鉴定。
1.1.2.1中药化学成分提取技术
传统化学成分的提取釆用有机溶剂浸渍、渗漉、回流、索氏提取等方法。除传统的提取方法外，超临界流体萃取、半仿生提取、微波萃取、超声提取、亚临界水萃取、固相萃取、高速逆流色谱提取、酶提取等一批新技术，已开始应用于中药化学成分的提取研究之中[24]。
1.1.2.2中药化学成分分离分析技术
传统的分离技术有两相溶剂萃取法、结晶法、透析法、升华法、分馈法、吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、大孔吸附树脂法、高效液相色谱法与气相色谱法。近年来，随着分析化学技术与仪器的不断进步，多种新的分离技术在中药成分分离分析中得到应用，主要有以下几种:

1.2化学衍生化法
化学衍生化法是利用化学反应，用化学衍生试剂给待测样品连上某些特殊基团，以改变待测物质的性质，如连上荣光或有紫外吸收基团，以增加样品的灵敏度；或者改变样品的极性大小，使其易于分离与检測。化学衍生化在紫外-可见分析、荧光分析、电泳与电化学分析、质谱、核磁等方面都有所应用以提高分析水平。衍生化的主要目的是用来提高检测灵敏度；通过改变样品混合物极性来改善分离特性；使成分易于结构鉴定。良好的衍生化反应应具有以下特点：衍生试剂通用性好，且方便易得；反应条件迅速，反应温和，反应产物稳定；过量的衍生试剂与反应副产物不干扰待测成分。
从衍生是否与系统联机，化学衍生化法分为在线(online)和离线(offline)两种；从衍生化反应发生的场合，可以分为柱前衍生化法、柱上衍生化法和柱后衍生化法。柱前衍生化方法在高效液相色谱法中应用最多。
柱前衍生化，是先将样品与衍生化试剂反应，生成的衍生物进行色谱分离，再利用紫外、红外、炎光、示差及质谱等检测器进行检测。该方法相比柱后衍生具有较大的自由性，具有以下优点：通常不考虑衍生化反应的动力学，直到衍生反应完全；样品的反应和纯化都可以以离线的方式实现，反应的时间和条件以及试剂的用量没有严格的限制，为了获得最佳衍生效果，可以任意选定衍生化条件；可以使用多种溶剂或混合试剂；衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其千扰。该法主要缺点为衍生化反应形成的副产物可能对色谱分离造成较大干扰，有时严重影响衍生化反应的重复性。目前文献报道柱前衍生法测定化合物的基团主要有氧基、羧基、轻基等[8]。
柱上衍生化，是将衍生试剂加入到流动相中，使待测物与流动相中的衍生试剂在柱上快速反应以进行测定的方法，适用于衍生物不稳定的情况。具有衍生试剂用量大，对色谱柱损伤大，分析成本高等缺点。目前主要应用于手性药物对映体的分离，它是基于衍生化试剂和药物对映体反应，形成非对映体的衍生化产物[8]。
柱后衍生化，待测样品先经过色谱柱进行分离后，然后对分离产物进行衍生化处理再进行检测。柱后衍生化是在色谱柱和检测器之间所接的反应器中进行的，它是一种在线的衍生化方法。最简单的反应器是用玻璃、聚四氟乙稀或不锈钢等材料制成的管状反应器(TubularReactor)，适应于滞留时间低于30s的快速反应。另一种是柱床反应器(BedReactor),它是由多孔玻珠填充的玻璃或毛细管柱，适用于滞留时间为l-5min的中等速度的反应，在玻珠上沉积一层衍生化反应物，当流动相经过时，其间的溶质就与衍生化试剂反应。对于滞流时间超过5min的反应，则需要载流式反应器(CarrierReactor)，它是一种长而细的盘管，为减少峰扩张，在洗脱液与试剂混合时不断地打入空气或不与流动相相溶的溶剂，使溶液在分割的情况下流动，这样可以使峰扩张小于10%。此外，对于只要光照条件下就可以发生结构变化的化合物，可以用光化学检测器(PhotochemicalReactor)[8]。柱后衍生化与柱前衍生化相比，因其在线完成衍生，操作简便，可自动地连续地进行分析，消耗衍生化试剂较少，未被衍生的化合物若有吸收时，同时也可进行分离和检测。该衍生化法要求衍生化反应时间短，重现性好，使反应条件受到了很大的限制；要求反应的副产物及过量的衍生试剂都不应影响检测，而且需要特定的反应器，所以限制了该方法的广泛应用。目前柱后衍生化HPLC法的应用不多。
化学衍生化方法可改善药物成分的紫外或荧光吸收特性、极性大小及测定的灵敏度，使其易于在现有条件下分离、表征与测定。

第二章中药中生物胺类成分鉴别与测定方法的建立
2.1引言
生物胺是一类含氮的低分子量碱性有机化合物，是微生物、植物与动物在细胞代谢过程中合成和降解的[63，64]。根据化学结构的不同，生物胺可以分为脂肪族（腐胺、尸胺、精胺与亚精胺），芳香族（酪胺、苯乙胺），与杂环胺（色胺、组胺）三类[63];根据氣基数量的不同，可将生物胺分为单胺化合物（酪胺、苯乙胺、色胺、组胺等）与多胺类化合物（腐胺、尸胺、亚精胺与精胺）。几种常见的生物胺结构如图2-1所示。
生物胺是生物体内的生理活性成分，在机体内起着重要的生理作用。多胺在细胞增殖分化、核酸功能调节、蛋白质合成、脑发育、神经生长和再生的调控等方面起到重要的作用[63_65],是生物细胞中内源性的和必须的物质。此外，生物胺也广泛存在于多种食品和饮料中，尤其是在富含蛋白质的食物如鱼和肉，发酵的食物如乳酪，有发酵过程的饮料如酒和醋[63，66]中更多。生物胺在机体内有非常重要的生理活性和毒理效应，低剂量摄入是人体不可或缺的生理活性物质，然而高剂量摄入生物胺，可引起皮疫、头痛、恶心、血压变化、心悸、颜内出血和过敏性休克等不良症状。由于生物胺的生理活性和毒性问题，关于生物胺的研究受到普遍关注。
2.1.1生物胺的生物合成
生物胺在生物体内最主要的生物合成途径是氣基酸经脱羧酶催化脱幾反应生成[63，M]。多胺类亚精胺与精胺是由腐胺合成而来。腐胺由精氨酸通过三个途径生成：一是精氨酸水解生成鸟氨酸，鸟氨酸经鸟氨酸脱幾酶脱羧生成腐胺；二是精氨酸经精氨酸脱羧酶脱幾后生成胍丁胺，狐丁胺水解生成N-氨基甲酰腐胺，而后N-氨基甲酰腐胺二次水解生成腐胺；三是精氨酸在转氨酶的作用下首先生成瓜氨酸，瓜氨酸经脱羧酶的作用生成N-氨基甲酰腐胺，N-氨基甲酰腐胺在水解酶的作用下生成腐胺。亚精胺的生成主要是通过丙基氨基转移酶II将脱羧-S-腺苷甲硫氨酸上的氨丙基转移到腐胺的一个氣基上合成，精胺的合成则需要腐胺结合两分子的氨丙基[70]。单胺类组胺、酪胺、苯乙胺与色胺和多胺类尸胺通过其前体氨基酸在相应脱敖酶的作用下合成，分别由组氨酸、酪氦酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸生成[71]。组氨酸在组氨酸脱幾酶的作用下生成组胺，酪氨酸在酪氨酸脱幾酶的作用下生成酷胺，苯丙氨酸脱幾生成苯乙胺，色氨酸在色氨酸脱梭酶作用下生成色胺，赖氨酸在赖氨酸脱酸酶作用下生成尸胺。5-轻色胺的生成是在色氨酸经化酶的作用下，首先将色氨酸轻基化生成5-轻色氣酸，然后在5-经色氨酸脱幾酶的作用下生成。合成途径见图2-2[72，73]。也有部分生物胺是通过醛酮类化合物的胺化或转氨作用形成的。

2.2实验材料与仪器
2.2.1实验材料
2.2.1.1标准品
甲胺(methylamine,MET)，色胺(tryptamine,TRP)，2-苯乙胺(2-phenylethylaniine，PEA),腐胺二盐酸盐(putrescinedihydrochloride,PUT)，尸胺二盐酸盐(cadaverinedihydrochloride,CAD),组胺二盐酸盐(histaminedihydrochloride,HIS)，5-轻色胺盐酸盐(serotoninhydrochloride,5-HT)，酪胺(tyramine,TYR)，亚精胺三盐酸盐(spermidinetrihydrochloride,SPD)，多巴胺盐酸盐(dopaminehydrochloride,DA),精胺四盐酸盐(sperminetetrahydrochloride,SPM),均购自Sigma-Aldrich公司（美国），纯度均大于98%。内标1，7-二氨基庚烧(1,7-diaminoheptane,DMP)购自Sigma-Aldrich公司（德国），衍生化试剂丹磺酰氯(Dansylchloride)购自Sigma-Aldrich公司（美国）。
2.2.1.2常规化学试剂
乙腈（色谱纯，Fisher公司），水为双蒸水。盐酸，三氯乙酸，高氯酸，碳酸氢钠，碳酸钠，氨水，氢氧化钠，正丁醇，二氯甲烧，丙酮均为分析纯（西安化学试剂厂）。
2.2.1.3药材
红花、大青叶、黄蔑、厚朴、麻黄、桃仁、枸杞子、陈皮、雄香蛾、冤丝子、补骨脂、韭菜子、菊声巴、炒杏仁、核桃仁、何首乌、拘杞子、淫羊藿、仙茅、盐杜仲、锁阳、肉灰蓉、巴戟天、续断、骨碎补与人参均购自北京同仁堂药店西安分店，经西北大学房敏峰教授鉴定为正品药材。
2.2.2实验仪器
LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有ShimadzuLC-10A二元菜；ShimadzuSPD-M10ADAD检测器；ShimadzuCTO-1OAS柱温箱；Shimadzu色谱工作站；色谱柱：Shimadzushim-packCig分析柱(250mmx4.6nimI.D.,Sum)与ShimadzuCig保护柱(12.5mmx4.6mmI.D.,5μm)。
UltiMateSOOO液质联用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪（德国Broker公司）。
SHA-C恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；V0RTEX-3旋祸馄合器(德国IKA);BP61S型精密电子天平(0.1mg-61g，德国赛多利斯)；PHS-3C精密pH计（上海精科雷磁）；微量移液枪(德国Eppendorf)。

第三章基于可能的生源关系鉴别与测定麻黄中的生物胺类成分……………………..50
3.1引言………………………………….50
3.2实验材料与仪器………………………………….51
3.2.1实验材料………………………………….51
3.2.2实验仪器………………………………….51
3.3实验方法………………………………….51
3.3.1标准溶液的配制………………………………….51
3.3.2样品溶液的制备………………………………….51
3.3.3生物胺的衍生化………………………………….52
3.3.4HPLC色谱条件………………………………….52
3.3.5高分辨质谱………………………………….52
3.3.6生物胺的含量计算………………………………….52
3.4结果与讨论………………………………….52
3.4.1麻黄与麻黄根中生物胺的鉴定………………………………….52
3.4.2麻黄与麻黄根中生物胺的含量测定………………………………….55
3.5本章小结………………………………….57
第四章中药中生物胺类成分的鉴别与测定………………………………….58
4.1引言………………………………….58
4.2实验材料与仪器………………………………….58
4.2.1实验材料………………………………….58
4.2.2实验仪器………………………………….60
4.3实验方法………………………………….60
4.3.1标准溶液的配制………………………………….60
4.3.2样品溶液的制备………………………………….60
4.3.3生物胺的衍生化………………………………….60
4.3.4HPLC色谱条件………………………………….60
4.3.5高分辨质谱………………………………….60
4.3.6生物胺的含量计算………………………………….60
4.4结果与讨论………………………………….60
4.4.1中药中生物胺的鉴定………………………………….60
4.4.2中药中生物胺的含量测定………………………………….62
4.5本章小结………………………………….65
第五章生物胺在宁夏枸杞中的分布………………………………….79
5.1引言………………………………….79
5.2实验材料与仪器………………………………….79
5.2.1实验材料………………………………….79
5.2.2实验仪器………………………………….79
5.3实验方法………………………………….80
5.3.1标准溶液的配制………………………………….80
5.3.2样品溶液的制备………………………………….80
5.3.3生物胺的衍生化………………………………….80
5.3.4HPLC色谱条件………………………………….80
5.3.5高分辨质谱………………………………….80
5.3.6生物胺的含量计算………………………………….80
5.4结果与讨论………………………………….80
5.5本章小结………………………………….83
第六章麻黄汤配伍成分变化研究………………………………….85
6.1引言………………………………….85
6.2实验材料与仪器………………………………….88
6.2.1实验材料………………………………….88
6.2.2实验仪器………………………………….89
6.3实验方法………………………………….89
6.3.1标准溶液的配制………………………………….89
6.3.2样品溶液的制备………………………………….89
6.3.3生物胺的衍生化………………………………….89
6.3.4HPLC色谱条件………………………………….89
6.4结果与讨论………………………………….90
6.5本章小结………………………………….91
第七章对溴异硫氰酸苯醋用于氨基酸的衍生化分析
7.1引言
氨基酸以酷胺键连接生成多肽，很多含有数个氨基酸的短肽具有重要的生物活性，如抗癌、降血压、降血糖与抗氧化等例如内源性成分谷胱甘肽（由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成）是体内重要的还原性物质，具有多种生物活性，特别是抗氧化活性。赖氨醜天冬氨醜异亮氨酸三肽可以促进脊髓损伤小鼠的功能再生。精氧酷甘氨酰天冬氧酸抗肿瘤转移、抗血小板聚集。脯氨醜亮氨醜甘氨酸抗帕金森病，赖氨酷组胺酷甘氨酸提高免疫与抗肿瘤等。中药多肽研究主要针对含蛋白质的动物药材，事实上植物性药材应该也含有蛋白质和多肽，只是由于分析方法的限制而进展有限。短肽与氨基酸类似，极性大，难以进行分离分析，它们很可能是中药极性成分中活性强、含量低、尚未被发现的一类。与氨基酸不同的是，氨基酸尚有专门的氨基酸分析仪，而短肽的结构比氨基酸复杂，种类更多，对其定性鉴别和定量测定都带来了极大的困难。由于短肽和氨基酸的性质有很大程度相似性，所以氨基酸的衍生方法也可以应用于短肽，这样也将促进中药短肽研究的进展。本章以氨基酸为例探索研究简便、特异性强的衍生化方法，希望该方法也能适用于短肽研究。
氨基酸种类较多，结构相近，除了少数几个含有苯环的氨基酸外，大多数氨基酸不含有发色基团，需要将氨基酸衍生为具有紫外-可见吸收或能产生焚光的衍生物，以提高分析灵敏度和分离的选择性。目前主要用直接分析法与衍生化的间接分析法对氨基酸进行分析与检测。直接分析法用基于离子交换色谱的氨基酸分析仪测定，不用衍生即可实现分析，但仪器价格昂贵、专属性强、且分析时间长，限制了其广泛的应用。目前对氨基酸的分析检测主要采用衍生化高效液相色谱法。用于氨基酸分析的衍生化试剂较多，主要有以下几种[183]：
邻苯二甲醛(OPA):OPA是较早用于氨基酸分析检测的一种衍生试剂。OPA与一级氨基酸在巯基乙醇存在下反应生成具有很强焚光的异嘲噪衍生产物（见图7-1)。OPA自身不发荧光从而不干扰测定，具有衍生步骤简单、反应速度快等优点。但其不能直接与二级氨基酸反应，且衍生产物不稳定，衍生后需立即进样分析。
异硫氰酸苯酷(Phenylisothiocyanate，PITC):在室温反应条件下，PITC与氨基酸反应生成苯氨基硫甲酞衍生物，在原有氨基酸结构中引入苯环，使氨基酸极性大大降低(见图7-2)。近年来，PITC法已成为普遍用于RP-HPLC分析氨基酸的方法之一。PITC可与一、二级氨基酸同时反应，获得单一和稳定的衍生产物，冻干衍生产物-2(rc可忙存30(1，4°C水溶液中可It存3d，色谱响应值无明显变化。但因其为挥发性强烈刺激性液体，人体吸入后会对呼吸道产生强烈的刺激作用。

结论
本研究利用衍生化方法对中药中含量小、水溶性大、没有紫外或突光基团的化学成分进行研究，取得的主要研究结果如下：
(1)运用化学衍生化、HPLC与MS等技术建立了鉴别与测定中药中生物胺类成分的方法。优化了11种生物胺丹横醜氯衍生化条件、样品测定的色谱条件，确定了中药样品前处理方法与中药中生物胺类成分的鉴别方法，并对含量测定方法进行了方法学验证。丹磺酰氯衍生11种生物胺需在碱性条件下完成反应，缓冲溶液的pH是影响衍生化的关键因素，本文选择pHlO碳酸钠-碳酸氧钠缓冲溶液进行衍生化；在优化的色谱条件下，11种生物胺与内标的丹磺酰氯衍生物可达基线分离。中药化学成分复杂且所含生物胺类成分含量低，选择适宜的方法从中药材中获得生物胺，对之后的分析鉴定至关重要；经考察，以1M盐酸为溶剂，提取2次，每次30mL提取60min可获得最佳的生物胺提取效率；选择正丁醇-二氯甲院(1:1,v/v)液-液萃取法对中药提取液中的生物胺进行除杂与富集，可除去中药中氨基酸类及水溶性成分的干扰，富集含量低生物胺的浓度。可通过更换流动相，样品中加标与MS结果相互印证鉴定中药中所含的生物胺。线性、检出限、精密度与回收率等方法学验证结果表明，本文建立的丹磺酰氯柱前衍生RP-HPLC方法可用于中药中生物胺的含量测定。
(2)从中药麻黄所含阿魏醜组胺和麻黄根碱的结构以及可能的生源关系推测其尚有未被发现的成分组胺、腐胺、亚精胺和精胺。利用本文建立的方法对麻黄及麻黄根中生物胺类成分的存在进行验证。结果证明了我们从阿魏酰组胺和麻黄根碱的结构及可能的生源关系推测麻黄中应该含有组胺、腐胺、亚精胺及精胺，这种推测是正确的。同时也为阿魏醜组胺很可能由阿魏酸和组胺缩合而来，麻黄根碱结构中的精胺部分由精胺、亚精胺和腐胺依次衍生而来的生物合成过程提供了强有力的证据。本研究的结果对于进一步理解和探讨麻黄的生物活性与其所含成分之间的关系会有帮助。
(3)鉴别与测定了146种常用中药中生物胺的类别及其含量。在146种常用中药中，大多数药含有腐胺、亚精胺、精胺与尸胺；一部分中药中含有甲胺与苯乙胺，含量均不太高；仅个别中药含有色胺、组胺、5-经色胺、酪胺与多巴胺，含量都很低。生物胺在花、叶、果实、种仁、部分根及根基类药材中含量较高，特别是在含蛋白质丰富的动物类及花粉类药材中含量较高。亚精胺在补气药、活血化疲药、部分补肾药、健脾运胃药及化痰药中含量高于其它类别中药，这与中医以补肾为主，辅以补气、补脾、活血、化痰抗衰老的理论相一致；且亚精胺含量高的中药，现代药理研究都具有一定的抗衰老作用。亚精胺与中药抗衰老作用具有一定的相关性，提示亚精胺可能是中药产生抗衰老作用的物质基础之一。动物类药材中生物胺总量较高，对动物类药材进行生物胺类成分研究，并制定其含量限度标准，对其正确安全的应用具有重要意义。

参考文献（略）