吡咯加合物作为慢性正己烷中毒早期神经损伤的生物标志物研究

【摘要】研究目的正己烷(n-hexane)是一种常用的工业溶剂,主要应用于粘胶配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制药、家具制造及电子元件制造等行业。正己烷的急性毒性较低,但长期慢性低浓度接触可导致以感觉运动型多发性周围神经病为主要临床特征的慢性中毒。目前关于正己烷的生物标志物的研究比较多,例如：2,5-己二酮、血影蛋白、神经骨架蛋白、髓鞘碱性蛋白、神经元特异烯醇化酶、神经生长因子等指标,但是,这些指标都存在一定的缺陷。并不是正己烷最理想的生物标志物。正己烷可在体内代谢为2,.5-己二酮(2,5-HD),2,5-HD与氨基残基可形成吡咯加合物。本研究以吡咯加合物为切入点,通过动物实验确定吡咯加合物能否成为正己烷的生物标志物?并确定其生物接触限值。研究方法1.方法建立。通过埃利希试剂建立吡咯加合物的测定方法；通过气相色谱仪建立2,5-HD的测定方法：2.离体研究。取大鼠的血清以及其他组织加入2,5-HD后,放入37℃培养箱中进行体外培养,研究在各种条件下吡咯加合物的生成情况,以及影响吡咯加合物生成的因素；3.毒代动力学研究。4组大鼠,其中2组大鼠,腹腔注射2,5-HD一次,剂量分别为200,400mg/kg,在染毒后1,2,4,8,24,48,72,96和120h,经过眼内呲取血和压痛取尿。另外2组大鼠,腹腔注射2,5-HD每天一次,连续5天,剂量分别为200,400mg/kg,在末次染毒后1,2,4,8,24,48,72,96,144,192,240,288,336,384h经过眼内呲取血和压痛取尿,进行尿和血清中吡咯加合物的测定。4.吡咯加合物组织分布与2,5-HD相关性研究。4组大鼠,分别给与500,1000,2000,4000mg/kg剂量的正己烷,连续5天染毒后,在第5次染毒后24h时刻处死大鼠,取血清、尿、肝、肾、大脑、脊髓等组织,对组织中的2,5-HD和吡咯加合物的浓度进行了测定,研究了2,5-HD和吡咯加合物的组织分布,以及在不同的组织中2.5-HD和吡咯加合物的相关性。5.吡咯加合物作为正己烷神经损伤生物标志物。6组大鼠,5组分别给与500,1000,1500,2000,4000mg/kg剂量的正己烷,1组对照给与等体积的生理盐水,每天1次,连续24周,每周一次经过眼内呲取血和压痛取尿,时间为染毒后8h和24h,同时对大鼠的步态行为学指标进行测定。分析吡咯加合物与神经损伤的相关性。研究结果1、2,5-HD和吡咯加合物测定方法吡咯加合物测定方法：取一定量的血清、尿、肝、肾等生物组织样品,加入生理盐水匀浆,取匀浆液加入盐酸胍消化,8000g离心后,取上清液加入埃利希试剂显色,通过酶标仪526nm进行测定。2,5-HD的测定方法：取一定量的血清、尿、肝、肾等生物组织样品,加入生理盐水匀浆,匀浆液中加入无水碳酸钾和盐酸胍,加入内标物(环己酮),加入二氯甲烷萃取后离心,取萃取液进气相色谱仪进行测定。若萃取液中2,5-HD浓度较低的样品,可使用氮气吹扫,将萃取液浓缩后,进行测定。2、吡咯加合物体外实验吡咯加合物的生成量与2,5-HD、组织的浓度具有剂量效应关系；吡咯加合物的生成速率与环境温度呈现正相关；在大脑、脊髓组织中吡咯加合物生成速度最快；人血清和大鼠血清吡咯加合物生成的速率不一样,吡咯加合物在人血清中的生成速率约为鼠血清的3倍；2,5-HD向吡咯加合物的转化过程并不是单方向的反应,而是一个动态的反应,当吡咯加合物达到浓度后,形成吡咯加合物的反应速度越来越低,最终,2,5-HD和吡咯加合物的浓度之间达到一种平衡。3、2,5-HD和吡咯加合物的毒代动力学吡咯加合物在血清中呈现一个时间蓄积的变化趋势,但是尿中的吡咯加合物、尿中2,5-HD、血清中2,5-HD保持一个稳定的数值,无蓄积趋势出现。血清中2,5-HD和吡咯加合物的半衰期分别为2.27±0.28h和25.3±3.34h。尿中吡咯加合物与血清(r=0.736,P<0.001)和尿(r=0.730,P<0.001)中2,5-HD的呈现相关性,血清中吡咯加合物与2,5-HD的累积暴露量呈现明显的相关性(r=0.965,P<0.001)。4、2,5-HD和吡咯加合物组织分布以及相关性组织中的2,5-HD和吡咯加合物与正已烷的染毒剂量呈现剂量效应反应关系。2,5-HD在尿中含量最高,坐骨神经中含量最低,但是,吡咯加合物在肝脏中的含量最高,血清中的含量最低。在同一组织中,游离2,5-HD、总2,5-HD和吡咯加合物具有显著的相关性,在不同的组织中,血清中的吡咯加合物与组织中游离的2,5-HD和吡咯加合物的相关性最强。5、吡咯加合物最大无作用剂量(NoAEL)的确定尿和血清中吡咯加合物与正己烷的染毒剂量有明显的剂量效应反应关系,尿和血清中的吡咯加合物的浓度在染毒后4周达到一个平台期。尿和血清中吡咯加合物的浓度与达到瘫痪时间呈现负相关,但是尿和血清中吡咯加合物的浓度与神经损伤的步态评分指标成正相关。大鼠吡咯加合物的NOAEL为染毒后8h,尿和血清的接触限值为84.6±12.1nmol/ml和7.7±1.97nmol/ml,在染毒后24h,尿和血清的接触限值为18.2±5.14和3.9±0.88nmol/ml.体外实验中,人血清中吡咯加合物的生成速度为大鼠血清中的3倍,因此,人体的接触限值为染毒后8h,尿和血清的接触限值为253.8±36.3nmol/ml和23.1±5.91nmol/ml,吡咯加合物在染毒后24h,尿和血清的接触限值为54.6±15.42nmol/ml和11.7±2.64nmol/ml.结论：1.吡咯加合物的生成不仅仅是一个简单的单向的化学反应,受到氨基酸浓度、2,5-HD、温度等因素的影响。2.吡咯加合物比2,5-HD半衰期长,并在血清中呈现蓄积效应,说明血清中的吡咯加合物可能适合作为正己烷的生物标志物。3.组织中吡咯加合物与2,5-HD有明显的相关性,且血清中的吡咯加合物与组织中的2,5-HD和吡咯加合物的相关最强,说明血清中的吡咯加合物最能有效的代表组织中的2,5-HD和吡咯加合物。4.通过动物实验推断吡咯加合物在人体的接触限值为染毒后8h,尿和血清的接触限值为253.8±36.3nmol/ml和23.1±5.91nmol/ml,吡咯加合物在染毒后24h,尿和血清的接触限值为54.6±15.42nmol/ml和11.7±2.64nmol/ml.
【作者】尹洪银；
【导师】谢克勤；
【作者基本信息】山东大学，卫生毒理学，2014，博士
【关键词】正己烷；2,5-己二酮；吡咯加合物；生物标志物；生物接触限值；

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