动脉粥样硬化中几丁质酶3样蛋白1的组织学表达及干预研究

【摘要】背景目的作为一种系统性疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)影响全身大中型动脉,已经成为冠状动脉疾病(coronaryarterydisease,CAD)的主要病理类型。研究证实AS是一种慢性炎症性疾病,主要表现为动脉管壁脂质及纤维基质堆积,管腔狭窄。根据“损伤-反应”学说,各种AS危险因素可以导致内皮细胞(endothelialcell,EC)功能障碍和(或)脱落,随后EC表达粘附分子增加,趋化血液单核细胞及T淋巴细胞粘附。单核细胞及T淋巴细胞进入内膜下启动炎性反应,分泌一系列细胞因子,如肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、单核细胞趋化蛋白(monocytechemoattractantprotein,MCP)、白细胞介素(interleukin,IL)等,可进一步激活EC、血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)及巨噬细胞,促进AS发展。几丁质酶3样蛋白1(chitinase3-like1,CHI3L1),又名软骨糖蛋白39、YKL-40、乳腺回归蛋白39,该蛋白质存在几丁质结合活性,但无几丁质酶活性。研究表明CHI3L1可由一系列细胞分泌,如呼吸道上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肿瘤细胞、VSMCs、巨噬细胞等。CHI3L1在急慢性炎症及细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)重构等疾病过程中起重要作用,如AS、支气管哮喘、高血压、糖尿病(diabetesmellitus,DM)等。虽然CHI3L1与AS关系密切,但AS患者外周血CHI3L1水平与冠状动脉狭窄病变程度存在争议。一项研究认为AS患者外周血CHI3L1水平与冠状动脉狭窄病变程度成正相关,另一项调查证实AS患者外周血CHI3L1水平与冠状动脉狭窄病变程度无关。为了进一步明确CHI3L1与CAD的关系,本研究选择行主动脉-冠状动脉旁路移植术(coronaryarterybypassgraft,CABG)时废弃的主动脉管壁组织,应用免疫组化检测CHI3L1蛋白表达,探讨人体动脉组织CHI3L1蛋白表达与AS发病机制的关系。材料方法1.研究对象(1)对象：选取2010年1月至2012年6月在山东省千佛山医院行CABG的39例患者作为研究组,其中男性患者27例,女性患者12例。对照组为11例亲属间肾脏移植手术供体者,均为男性,经入院查体均排除各种器质性疾病。(2)标本：研究组患者行CABG时留取废弃的全层主动脉组织,39例CABG取得动脉组织81块。对照组供体者行肾脏移植手术时留取废弃的肾动脉组织,11例肾脏移植取得动脉组织55块。2.生化分析所有研究组患者入院后测定静脉血浆甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(totalcholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoproteincholesterol,HDL-C)、脂蛋白(a)(lipoprotein(a),Lp(a)、载脂蛋白A(apolipoproteinA,ApoA)、载脂蛋白B(apolipoproteinB,ApoB)、总胆红素(totalbilirubin,TBIL)、直接胆红素(directbilirubin,DBIL)、间接胆红素(indirectbilirubin,IBIL)、等生化指标。3.冠状动脉造影所有研究组患者CABG前行冠状动脉造影(coronaryangiography,CAG)检查明确冠状动脉狭窄部位、范围及程度,有无钙化及迂曲,并利用Gensini积分方法定量评价患者冠状动脉病变情况。4.组织准备及免疫组化研究组及对照组动脉管壁组织经常规固定、脱水、石蜡包埋后切片,石蜡组织切片经常规脱蜡、抗原修复、滴加兔抗人CHI3L1多克隆抗体孵育、显色后行免疫组化,并应用图像分析系统测定CHI3L1相对表达量。结果1.研究组和对照组基本情况比较研究组39例患者中合并吸烟者8例,高血压17例,DM15例。11例肾脏移植手术供体者无吸烟、高血压及DM病史。研究组患者血浆TG、TC、LDL-C及Lp(a)测定值较正常参考值显著升高,血浆HDL-C及ApoA测定值与正常参考值相比明显降低,p<0.05；血浆ApoB测定值虽然较正常参考值升高,但差异无统计学意义,p>0.05。研究组患者血浆TBIL及IBIL测定值较正常参考值显著降低,p<0.05；血浆DBIL测定值虽然较正常参考值降低,但差异无统计学意义,p>0.05。2.CAG研究组39例患者中合并左冠状动脉主干病变19例,三支病变14例,二支病变或合并左冠状动脉前降支近端病变6例。CAG提示冠状动脉均有不同程度的钙化、狭窄和迂曲,并且侧支循环建立不完全。采用Gensini积分系统进行定量积分以评价CAD严重程度,研究组39例患者Gensini积分平均为62.25±21.77(24-120)。3.研究组和对照组动脉组织CHI3L1表达研究组主动脉管壁组织经免疫组化检测均有CHI3L1表达,阳性表达主要分布于EC及VSMCs胞浆,表现为棕褐色或棕黄色,分布不均匀,呈颗粒状、片状、簇状及条纹状。对照组肾动脉管壁组织经免疫组化检测显示CHI3L1表达明显减少,着色表现为浅蓝色或无色,两者相比差异有统计学意义,p<0.05。4.研究组动脉组织CHI3L1表达量与AS主要临床危险因素的关系研究组患者CHI3L1相对表达量性别之间比较,差异无统计学意义,p>0.05；吸烟者与非吸烟者,高血压患者与非高血压患者,DM患者与非DM患者之间比较,差异均有统计学意义,p<0.05。研究组患者CHI3L1相对表达量与冠状动脉狭窄病变Gensini积分相关性分析表明两者呈正相关(r=0.611,P<0.05)。结论1.本研究利用人CABG时主动脉打孔废弃的主动脉组织为标本,检测动脉组织CHI3L1蛋白表达量较正常对照明显升高,为国内外首次报道。2.本研究采用人活体动脉组织为样本,其研究结果提高了科学性、准确性及可信度,为研究AS发病机制增加了新的途径。3.本研究显示CHI3L1蛋白表达量与AS主要临床危险因素、冠状动脉狭窄病变程度成正相关。AS主要临床危险因素可促进CHI3L1表达,CHI3L1可能通过调节AS主要临床危险因素在AS发病中起作用。背景目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是慢性炎症性疾病,影响全身大中型动脉,已经成为冠状动脉疾病(coronaryarterydisease,CAD)的主要病理类型。各种AS危险因素可以导致内皮细胞(endothelialcell,EC)功能障碍和(或)脱落,趋化血液单核细胞及T淋巴细胞进入内膜下启动炎性反应,并分泌一系列细胞因子,进一步激活EC、血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)及巨噬细胞,促进AS发展。几丁质酶3样蛋白1(chitinase3-like1,CHI3L1)存在几丁质结合活性,但无几丁质酶活性。研究表明CHI3L1可由一系列细胞分泌,如呼吸道上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肿瘤细胞、VSMCs,巨噬细胞等。CHI3L1在急慢性炎症及细胞外基质重构等疾病过程中起重要作用,如AS、支气管哮喘、高血压、糖尿病等。人CHI3L1主动脉组织学研究显示,AS患者主动脉组织CHI3L1高度表达,为验证临床研究结果,本研究建立动物模型进行实验研究,以验证临床人活体主动脉组织研究的结果。为此本研究构建了有效慢病毒载体,使之能够携带针对小鼠CHI3L1的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),并将慢病毒悬液局部转染ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织,观察CHI3L1基因沉默在延缓AS进展及稳定AS易损斑块中的作用。材料方法1.细胞培养人胚肾细胞系293T细胞能够表达猿猴病毒40大T抗原,有利于慢病毒生产。选择小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞作为慢病毒体外转染的靶细胞。293T细胞及RAW264.7细胞于37℃在含有10%胎牛血清、100U/mlpenicillin、100μg/mlstreptomycin,5%CO2的DMEM中培养。2.慢病毒构建及有效靶点筛选设计4条针对小鼠CHI3L1基因的小发卡RNA(smallhairpinRNA,shRNA)序列(siteA、siteB、siteC及siteD)。siteA的序列为：5’-GCGACAACATGCTTAGCACATTTCAAGAGAATGTGCTAAGCATGTTGTCGCTT-3’;siteB的序列为：5’-GGCCATTGACACTGGCTATGATTCAAGAGATCATAGCCAGTGTCAATGGCCTT-3’;siteC的序列为：5’-GCACTGGATTTGGATGATTTCTTCAAGAGAGAAATCATCCAAATCCAGTGCTT-3’;siteD的序列为：5’-GCCAGAAGGACACTAGGTTTGTTCAAGAGACAAACCTAGTGTCCTTCTGGCTT-3’c作为阴性对照,随机不相关序列为：5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTT-3’。分别构建包含上述各干扰序列的穿梭质粒载体(pShuttlevectors),然后将pShuttlevectors与pGag/Pol、pRev、pVSV-G共同转染293T细胞。慢病毒体外转染RAW264.7细胞筛选有效干扰序列。收集培养72h及96h的RAW264.7细胞进行RT-PCR及westernblot分析,了解各干扰序列的干扰效率。3.动物实验50只雄性8周龄ApoE-/-小鼠饲养于SPF级饲养室,全程高脂饮食喂饲,随机分为CHI3L1慢病毒基因沉默组及空病毒载体阴性对照组。所有ApoE-/-小鼠均行右侧颈动脉套管术,术后8周颈动脉斑块组织局部转染慢病毒悬液(滴度均为1×109TU/ml)。4.组织准备及免疫组化ApoE-/-小鼠经慢病毒转染干预4周后分离颈动脉斑块组织,经常规固定、脱水、包埋后切片。组织切片分别进行HE染色、CHI3L1免疫组化、油红O染色(冰冻切片)、天狼猩红染色、VSMCsα-actin免疫组化、CD68免疫组化。5.电镜检查ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经3%戊二醛固定、漂洗、1%锇酸固定、脱水、Spon812包埋,然后经半薄切片定位,制作超薄切片。切片经柠檬酸铅和醋酸铀电子染色,应用JEOL-1011型透射电镜观察。6.RT-PCR分析利用RT-PCR技术分别检测RAW264.7细胞中CHI3L1mRNA表达水平及ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中CHI3L1、TNF-α、MCP-1、IL、MMP-9mRNA表达水平。7.Westernblot分析RAW264.7细胞中CHI3L1蛋白表达及ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中CHI3L1、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT蛋白表达水平应用westernblot技术检测。结果1.慢病毒构建及有效靶点筛选慢病毒构建完成后转染RAW264.7细胞,RT-PCR分析表明siteA、siteB、siteC及siteD干扰序列基因沉默分别减少CHI3L1mRNA表达量32%、17%、65%及30%。Westernblot分析表明siteA、siteB、siteC及siteD干扰序列基因沉默分别减少CHl3L1蛋白质表达量38%、18%、64%及14%。结果提示SiteC为最有效的干扰序列,最终慢病毒悬液滴度为1×109TU/ml,用于下游ApoE-/-小鼠体内实验。2.慢病毒体内转染效应对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经CHI3L1免疫组化可见阳性表达,主要分布于EC及VSMCs胞浆,表现为棕褐色或棕黄色。基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经免疫组化提示CHI3L1表达明显减少,表现为浅蓝色或无色。RT-PCR及westernblot分析结果表明基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中CHI3L1mRNA及蛋白表达量较对照组ApoE-/-小鼠明显减少,两者相比差异有统计学意义,p<0.05。3.电镜检查对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经电镜检查提示EC及VSMCs中存在大量脂质颗粒及胆固醇结晶,EC连接中断,VSMCs以合成型为多。基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织经电镜检查表明EC及VSMCs中可见少量脂质颗粒及胆固醇结晶,钙化多见,EC连接及基底膜大多完整,VSMCs以收缩型为多。4.慢病毒体内转染对AS斑块构成的影响对照组ApoE-/-小鼠及基因沉默组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织中脂质相对含量分别为48.8%、35.2%,两者相比后者脂质减少27.5%；胶原相对含量分别为19.5%、29.8%,两者相比后者胶原增加53.2%；VSMCs相对含量分别为14.8%、22.5%,两者相比后者VSMCs增加51.2%；巨噬细胞相对含量分别为11.9%、7.5%,两者相比后者巨噬细胞减少36%,差异均有统计学意义,p<0.05。5.慢病毒体内转染对AS斑块炎症因子及信号转导蛋白的影响RT-PCR分析表明基因沉默组ApoE-/-小鼠较对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-8、MMP-9mRNA表达水平均明显减少,差异均有统计学意义,p<0.05。Westernblot分析表明基因沉默组ApoE-/-小鼠较对照组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块组织p-ERK1/2及p-AKT蛋白表达水平均明显减少,差异均有统计学意义,p<0.05。结论1.应用RNA干扰技术可以有效构建针对小鼠CHI3L1基因的慢病毒载体。2.本研究发现ApoE-/-小鼠经慢病毒载体介导的CHI3L1基因沉默干预能够改善易损斑块稳定性,验证了临床人活体主动脉组织研究的结果。3.CHI3L1基因沉默可作为抑制AS斑块进展的一个新途径,为治疗AS提供新的思路和方法。
【作者】巩祖顺；
【导师】邢启崇；
【作者基本信息】山东大学，内科学，2014，博士
【关键词】动脉粥样硬化；炎症；危险因素；主动脉-冠状动脉旁路移植术；几丁质酶3样蛋白1；基因沉默；易损斑块；

【参考文献】
[1]陈炽.IT制造业激励机制研究[D].重庆大学,工商管理,2003,硕士.
[2]匡敏驰,朱纪洪,吉敬华.航空油泵电机的相电流畸变纠正控制[J].控制与决策,2015,05:899-904.
[3]雷雳.ETFs与成分股流动性的相互影响[D].厦门大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[4]李娇.低碳经济下株洲市清水塘工业区污染型企业低碳化改造研究[D].湖南师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[5]盛仁磊.煤炭销售管理系统的设计与实现[D].西安科技大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[6]刘琴.《记忆简介》（第三章和第五章）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[7]王尚轸.电网现场标准化作业管理系统的设计[D].南昌大学,计算机技术（专业学位）,2012,硕士.
[8]张荣生.基于处理器CK610的音频解码系统设计[D].哈尔滨工业大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[9]肖正再,王平.市场导向型会计信息披露模式构建[J].会计研究,2007,05:17-24+95.
[10]王译兴.国际碳金融财政政策支持的比较研究[D].吉林大学,金融学,2013,硕士.
[11]谢启友.基于非均衡通道的NAND Flash混合存储技术研究[D].国防科学技术大学,电子科学与技术,2012,硕士.
[12]高梅.运动模糊的点扩展函数及图像恢复研究[D].华北工学院,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[13]成洁.房屋修缮工作的改革与管理[J].中国高校后勤研究.1996(02)
[14]樊蓉.物流配送中车辆调度算法的比较研究[D].南京农业大学,物流工程,2013,硕士.
[15]魏勤.任务型教学法在中专护理专业英语口语教学中的运用[D].华东师范大学,教育,2003,硕士.
[16]王媛媛.小型单圈绝对式光电编码器关键技术研究[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,机械电子工程,2012,硕士.
[17]吴昱.备用信用证在中国的法律适用[D].外交学院,国际法,2004,硕士.
[18]胡晓晖.FDI投资动机的区分方法与检验[D].东北师范大学,产业经济学,2012,硕士.
[19]韩京清.非线性状态误差反馈控制律──NLSEF[J].控制与决策,1995,03:221-225+231.
[20]马艳营.黑龙江省煤炭资源开发利用“三率”问题研究[D].中国地质大学（北京）,公共管理,2014,硕士.
[21]李瑞云.氧化石墨烯对聚合物分离膜的亲水改性研究[D].大连理工大学,2012.
[22]祁媛.基于关联规则的旅行社项目风险评估的研究[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2013,硕士.
[23]张凯.RFID在VMI系统中应用的效益分析[D].青岛大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[24]覃骋.SAR/GMTI车辆目标微动信号仿真、提取和特征分析[D].杭州电子科技大学,控制工程,2014,硕士.
[25]卢莹.卡铂-PECE水凝胶大鼠腹腔药物代谢动力学研究[D].遵义医学院,妇产科学,2014,硕士.
[26]袁宇波,李德佳,陆于平,许扬,李澄.变压器和应涌流的物理机理及其对差动保护的影响[J].电力系统自动化,2005,06:9-14.
[27]温明伟.第三十届奥运会中外女排技战术竞技能力的对比研究[D].山东师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[28]裴井纯.论王鼎钧的文学观[D].山东师范大学,文艺学,2013,硕士.
[29]张爱丽.试析文化因素对俄罗斯外交政策的影响[D].河北师范大学,国际政治,2004,硕士.
[30]陈志波.南京国民政府社团法制研究[D].苏州大学,中国史,2014,博士.
[31]闫春.文化产业R&V联盟伙伴选择对联盟绩效的影响研究[D].哈尔滨理工大学,会计学,2012,硕士.
[32]柳春.惩罚性损害赔偿制度研究[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.
[33]张红强,刘健辰.基于二次分离方法的时变时滞系统稳定性分析[J].控制与决策,2011,10:1596-1600.
[34]张月红.青钱柳叶三萜类化合物提取纯化、分离鉴定及其抑菌活性研究[D].江西农业大学,农产品加工及贮藏工程,2012,硕士.
[35]刘美丽.中国海外并购技术整合风险案例研究[D].浙江大学,2013.
[36]张波琦.TCSC的模糊自适应backstepping控制设计[D].辽宁工业大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[37]王建平.马克思意识形态批判理论研究[D].西北师范大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[38]张方晓.“脚手架”模型支持学习环境设计研究[D].华东师范大学,教育技术学,2004,硕士.
[39]娄永录.地铁线路设计中几个技术问题的分析与探讨[J].城市轨道交通研究.2003(05)
[40]张利军,孟杰,兰海,刘艳红.带有SMES和电力推进负载的舰船电力系统鲁棒协调控制[J].控制与决策,2011,12:1808-1812.
[41]曾少林.基于磁性纳米组装材料分离富集环境中的6种指示性多氯联苯单体的分析方法研究[D].宁波大学,2013.
[42]唐建昌.交通建设工程质量监管研究[D].西南交通大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[43]金耀民.机场环境污染预测及软件开发[D].浙江工业大学,环境工程,2004,硕士.
[44]张旭斌.浅埋大跨小间距黄土隧道变形规律研究[D].北京交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[45]尹郁琦.汽车乘员舱热舒适性研究与改进[D].湖南大学,车辆工程,2011,硕士.
[46]凌泓.BRCA1相关基因单核苷酸多态性与三阴性乳腺癌易感性的研究[D].复旦大学,肿瘤学,2013,博士.
[47]李勇.原油运作过程中输油管道输油方案的研究[D].广东工业大学,工业工程,2013,硕士.
[48]马光大.Sialon陶瓷泥浆泵缸套的研制[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2012,硕士.
[49]高丽.家蚕追寄蝇寄生家蚕血液差异蛋白组学的研究[D].江苏科技大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[50]席德强.“问题引领”在高中生物教学中的应用[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.