过表达TIPE2基因诱导大鼠心脏移植免疫耐受

【摘要】目的：构建一株能稳定过表达TIPE2（Tumornecrosisfactor-α-inducedprotein-8like-2,TNFAIP8L2）基因的重组腺病毒。使用重组腺病毒过表达TIPE2基因预处理大鼠同种异体心脏腹腔异位移植的模型(OnO,s模型)，研究过表达TIPE2基因能否影响受体自身免疫调节和移植免疫排斥反应，并探索该基因诱导受体大鼠产生免疫耐受的可能性以及其具体作用机理。方法：将TIPE2基因的CDS区装载于人工合成的重组腺病毒载体AdC68上，包装成能在体内、外稳定地过表达TIPE2蛋白的重组腺病毒。分别将供体和受体大鼠随机分成五组：A组（空白组）：仅行Wistar大鼠到SD大鼠腹腔异位心脏移植术，手术成功后不作任何处理；B组（FK506处理组）：行Wistar大鼠到SD大鼠腹腔异位心脏移植，手术成功后连续给免疫抑制剂FK5060.5mg/Kg.d；C组（重组腺病毒处理组）：行Wistar大鼠到SD大鼠腹腔异位心脏移植，手术成功后尾静脉注入1×1011VPs重组腺病毒；D组（FK506联合重组腺病毒处理组）：行Wistar大鼠到SD大鼠腹腔异位心脏移植，手术成功后连续给半量免疫抑制剂FK5060.25mg/Kg.d，同时经尾静脉注入1×1011VPs重组腺病毒；E组（非相关重组腺病毒处理组）：行Wistar大鼠到SD大鼠腹腔异位心脏移植，手术成功后经尾静脉注入1×1011VPs非相关重组腺病毒；检测指标：供心的存活时间及其病理变化；分别移植成功后第7天检测各组移植受体大鼠外周血单个核细胞中CD4+CD25+Treg细胞百分比；外周血中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等细胞因子浓度的变化；蛋白印迹法检测脾组织、下腹部引流淋巴结中TIPE2蛋白的表达率以及real-timePCR法检测下腹部引流淋巴结中FoxP3的mRNA表达情况。结果：（1）TIPE2基因CDS区成功构建至人工合成的重组腺病毒载体AdC68上，并且能在体内、外稳定过表达TIPE2蛋白。（2）平均存活时间（MST）：A组：9±1.6天；B组：26.3±3.8天；C组：33.4±3.5天；D组：48±6.6天；E组：28.8±6.1天。与A组相比，B、C、D、E组受体大鼠的供心存活时间明显延长，P均＜0.05，数据有统计学差异；与B组相比，C组受体大鼠供心平均存活时间明显延长，P＜0.05，数据有统计学差异；与A、B、C、E组相比，D组受体大鼠供心存活时间明显延长，P均＜0.05；数据有统计学意义；B与E相比，受体大鼠供心存活时间无明显延长，P>0.05，数据无统计学差异。（3）受体外周血单个核细胞中CD4+CD25+Treg细胞比例检测结果：A组：1.70±0.66%；B组：6.42±1.17%；C组：9.38±1.13%；D组：31.34±2.23；E组：1.70±0.72%；与A、B、C、E组相比，D组CD4+CD25+Treg细胞比例显著增高，P＜0.05，结果有统计学意义；与B组相比，C组CD4+CD25+Treg细胞比例显著增高，P＜0.05；数据有统计学差异，与A组相比，B、C、D组CD4+CD25+Treg细胞比例均明显增高，P＜0.05，结果均有统计学差异；(4)外周血IL-2（pg/ml）:A组:2007.32±464.67;B组:1142.64±83.09；C组：735.59±194.55；D组：515.38±50.60；E组：915.76±180.60。A、B、E组相比，D组受体大鼠外周血中IL-2表达量明显降低，P<0.05，数据有统计学意义；C组受体大鼠外周血中IL-2表达量较B组明显降低，P<0.05，数据有统计学差异；B、C、D、E组受体大鼠外周血中IL-2表达量较A组明显降低，P<0.05，数据有统计学意义；B与C相比，受体大鼠外周血中IL-2表达量有明显差异，P<0.05，数据有统计学意义；D与C相比，IL-2表达量无明显差异，P＞0.05，数据无统计学差异。（5）外周IL-4(pg/ml):A组:27.26±21.29；B组：136.53±55.54；C组：213.25±89.48；D组：444.37±36.73；E组：166.84±58.16。D组受体大鼠外周血中IL-4表达量较A、B、E组明显升高，P<0.05，数据有统计学意义；D组受体大鼠外周血中IL-4表达量较B组明显升高，P<0.05，数据有统计学差异；与A组相比，B、C、D、E组受体大鼠外周血中IL-4表达量明显升高，P<0.05，数据有统计学意义；B组受体大鼠外周血中IL-4表达量与C、E组无明显差别，P＞0.05，数据无统计学差异；（6）外周血IL-10(pg/ml):A组：13.92±4.17；B组：14.75±9.17；C组：32.70±10.01；D组：78.18±13.31；E组：33.95±14.50；D组受体大鼠外周血中IL-10表达量较A、B、C、E组明显升高，P<0.05，数据有统计学意义；与B组相比，C组受体大鼠外周血中IL-10表达量明显升高，P<0.05，数据有统计学差异；C、D、E组受体大鼠外周血中IL-10表达量较A组明显升高，P<0.05，数据有统计学意义；C与E、A与B相比，受体大鼠外周血中IL-10表达量无明显差异，P均＞0.05，数据无统计学差异。(7)外周血TNF-α(pg/ml)：A组：1665.43±209.06;B组：821.97±271.40;C组:369.33±122.58;D组：214.80±35.84；E组：1148.99±140.63。D组受体大鼠外周血中TNF-α表达量较A、B、E三组明显降低，P<0.05，数据有统计学意义；C组受体大鼠外周血中TNF-α表达量较B组明显降低，P＜0.05，数据有统计学差异；B、C、D、E组受体大鼠外周血中TNF-α表达量较A组明显降低，P<0.05，数据有统计学意义；D与C相比，受体大鼠外周血中TNF-α表达量无明显差异，P＞0.05，数据无统计学意义。（8）外周血IFN-γ(pg/ml)：A组:6769.31±1659.95；B组：6290.93±1124.97；C组：3739.59±493.21；D组：2840.97±444.67；E组：5367.94±183.96。D组受体大鼠外周血中IFN-γ表达量较A、B、E三组明显降低，P<0.05，数据有统计学意义；C组受体大鼠外周血中IFN-γ表达量较B组明显降低，P<0.05，数据有统计学差异；B、C、D、E组受体大鼠外周血中IFN-γ表达量较A组明显降低，P<0.05，数据有统计学意义；D与C相比，受体大鼠外周血中IFN-γ表达量无明显差异，P＞0.05，数据无统计学意义。（9）下腹部引流淋巴结中FoxP3的mRNA表达情况：D组FoxP3的mRNA表达量较A、B、C、E明显升高，P＜0.05，有统计学意义；A、B、C、E组间相互比较，FoxP3的mRNA表达量无明显差异，P＞0.05，无统计学差异。（10）受体脾脏组织及下腹部引流淋巴结中TIPE2蛋白表达情况：C组与D组TIPE2蛋白表达较A、B、E组明显升高。C组与D组之间TIPE2蛋白表达量无明显差异。结论：（1）TIPE2基因能够成功构建于人工合成的重组腺病毒载体AdC68上；应用该腺病毒载体，能在体内、外稳定过表达TIPE2基因。（2）应用重组腺病毒载体在心脏移植受体大鼠体内过表达TIPE2基因，能下调TNF-α、IFN-γ、IL-2表达水平，上调IL-4、IL-10的表达水平，减轻急性排斥反应，延长供心在受体内的存活时间。（3）过表达TIPE2基因的受体大鼠，增加CD4+CD25+Treg细胞比例，减轻移植排斥反应。（4）我们可以从大鼠同种异体异位腹腔心脏移植模型中观察到，重组腺病毒诱导大鼠心脏移植免疫耐受的效果优于FK506，其能更加有效的减轻排斥反应的严重程度，延长心脏移植供心的存活时间。（5）重组腺病毒和FK506联合处理大鼠心脏移植模型，与单用重组腺病毒载体处理大鼠心脏移植模型，都可使心脏移植物的存活时间明显延长，明显减轻急性血管性排斥反应的严重程度，然而其仍然不能完全克服心脏移植急性排斥反应的发生。
【作者】张有斌；
【导师】余云生；
【作者基本信息】苏州大学，胸心血管外科，2014，硕士
【关键词】重组腺病毒；TIPE2基因；同种异体心脏移植；免疫耐受；

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