间充质干细胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的研究

【摘要】目的：对脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs）及人汗腺细胞（humansweatglandcells,h-SGCs）分离培养，找出脐带间充质干细胞的体外合适培养环境，探讨利用细胞融合技术将脐带间充质干细胞和人汗腺细胞在聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）的作用下诱导融合，研究合核细胞的生物学特性，为汗腺再生探索一条新的方法和途径。方法：1UC-MSCs的分离、培养和鉴定：获取无菌足月剖宫产健康胎儿脐带，剔除血管（两条动脉、一条静脉）并用镊子取出脐带中的沃顿胶组织(Wharton’sJelly)剪成大小约1mm3的组织块。将组织块按适当密度接种于培养板中，当镜下观察到组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块，添加培养液继续培养。当细胞达到一定密度时适时传代，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化，按104/cm2传代培养。流式细胞术检测细胞表面抗原表达情况。2UC-MSCs的标记：将第二代脐带间充质干细胞消化后制单细胞悬液，离心，取细胞沉淀，用稀释液C重悬细胞,迅速加入到PKH26工作液（PKH26染料250倍稀释）中染色1-5min，血清终止反应，DMEM/F12完全培养基洗涤2次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记结果。倒置相差显微镜下观察标记后细胞形态。3UC-MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：用MTT比色法分别检测不同浓度的胎牛血清在490nm处，吸光度值的均数(OD值)。同样用MTT比色法分别检测干细胞不同种植密度在490nm处，吸光度值的均数(OD值)。观察传代后不同时期干细胞的生长情况并绘制生长曲线。4汗腺细胞(h-SGCs)的培养：取正常全层头部皮肤去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小组织块，用Ⅱ型胶原酶消化法获得汗腺组织，汗腺培养基培养，大部分汗腺团块汗腺细胞(h-SGCs)贴壁爬出后，进行换液，已后3-4天换液一次。对培养的细胞进行免疫组化检测，看CEA和CK19表面抗原的表达情况。5汗腺细胞的标记：将第一代汗腺细胞消化后制单细胞悬液，离心，取细胞沉淀，加入CFDASE细胞标记液和CFDASE储存液（2X）进行标记，完全培养液（含血清）终止标记，洗涤三次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记效果。6间充质干细胞/汗腺细胞的融合、筛选及干细胞/汗腺细胞融合体的鉴定：融合方法：分别取对数生长期已标记的P3代脐带间充质干细胞和已标记的P0代汗腺细胞，用5mlGENMED清理液(reagentA)清洗，离心，去上清后用GENMED清理液(reagentA)洗涤，取细胞沉淀加入GENMED融合液（reagentB）进行融合，用GENMED清理液(reagentA)洗涤终止反应，去上清后正常培养。筛选方法：将标记后的融合细胞稀释置于96孔板，用荧光显微镜观察，标记出红色荧光和绿色荧光均显示的孔，将标记孔内的细胞汇入到一个孔内培养，视细胞生长情况及时检测并扩大培养。鉴定方法：将培养的融合细胞分别进行免疫组化法检测CEA和CK19表面抗原的表达情况和流式细胞术检测融合细胞表面标志物的表达率。同时以汗腺培养基培养的UC-MSCs作为对照，检测CEA和CK19阳性细胞的比例。结果：1UC-MSCs分离、培养、鉴定：培养5-7d后,已有少量脐带组织块爬出成纤维样细胞。二周后，可见部分组织块爬出成纤维样细胞，给予换液。之后2-3天给予换液一次，传1、2代(P1、P2)的UC-MSCs呈长梭行，形态均一。培养至九代(P9)的UC-MSCs，细胞生长缓慢，形态开始发生变化，折光性变得较差，培养至十二代的(P12)UC-MSCs部分细胞开始脱壁凋亡。对分离培养的UC-MSCs进行流式细胞术检测，干细胞表面标志物CD44、CD105、CD29表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞为较纯化的UC-MSCs。2经荧光显微镜下观察经PKH26染料标记的干细胞呈现红色荧光，通过计算标记率达到98%。倒置相差显微镜下观察，标记后细胞形态仍然成长梭形。3UC-MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：当胎牛血清浓度为10%时MTT比色法检测的OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量多。当种植密度为105/ml时MTT比色法检测的OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量多。从绘制的细胞生长曲线来看，接种后的UC-MSCs生长状况包含三期，滞留期、生长对数期、平台期。4汗腺细胞(h-SGCs)的培养：培养7天后，已有汗腺贴壁，镜下可见少量汗腺团块周围爬出不规则形细胞，呈集落状生长；10天后，镜下可见汗腺团块周围爬满不规则细胞，呈铺路石样生长。5经荧光显微镜下观察经CFDASE细胞标记液标记的汗腺细胞呈现绿色荧光，通过计算标记率达到99%。6干细胞/汗腺细胞融合细胞鉴定：将干细胞/汗腺细胞融细胞进行免疫组化检测细胞特异抗原，CEA和CK19包浆染色为棕色，为阳性。将干细胞/汗腺细胞融合体进行流式细胞术检测，表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达。结论：本实验通过研究人脐带间充质干细胞分离后，在不同条件下培养、诱导及鉴定，得出人脐带间充质干细胞的最优培养条件。并进一步通过细胞融合技术获得干细胞/汗腺细胞融合细胞，检测融合细胞表面标记物的表达率和表面抗原的表达情况，得到以下结论：1流式细胞术检测培养细胞的表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞较纯，可以用于实验研究。2PKH26染料可以作为活体示踪染料，在荧光显微镜下呈现红色荧光，染色较均匀，且不影响细胞的正常传代。3在实验中我们发现UC-MSCs最适宜的生长环境为：培养液中胎牛血清和DMEM(L)培养基的配比是1:9，最适宜的种植密度是105/ml。UC-MSCs生长曲线呈近似“S”型，从实验中我们发现P3以内的UC-MSCs形态稳定、适应性强、代谢旺盛。如果条件允许，最好使用三代内的干细胞做实验。4CFDASE进入细胞后分解成CFSE可以作为活体示踪染料，在荧光显微镜下呈现绿色荧光，染色较均匀，且不影响细胞的正常传代。5经鉴定诱导融合后的干细胞/汗腺细胞融细胞，免疫组化检测CEA和CK19表面抗原均为阳性，流式细胞术检测表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达。提示诱导融合后的干细胞/汗腺细胞融合体同时具备部分干细胞和汗腺细胞的生物学特性。
【作者】刘坤坤；
【导师】杨建民；
【作者基本信息】河北医科大学，外科学，2014，硕士
【关键词】人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)；人汗腺细胞(h-SGCs)；融合细胞；聚乙二醇化学融合法；荧光显微镜；

【参考文献】
[1]慎涵.一种基于PCM的文件系统设计与实现[D].华中科技大学,计算机技术,2013,硕士.
[2]马晓飞,王欣.中国铁路运输收入清算问题的市场化改革研究[J].理论月刊,2015,04:125-129.
[3]平英华,胡进鑫,何生保.我国设施农业发展体系建设构想[J].农业开发与装备.2007(03)
[4]潘变.桥式起重机箱形主梁的结构仿生优化设计[D].中北大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[5]华晓慧.武汉市家长参与幼儿园教育的现状研究[D].华中师范大学,学前教育,2013,硕士.
[6]衣莉媛.湖湘地域性美术课程资源在基础美术教育中的开发利用[D].湖南师范大学,艺术学,2013,硕士.
[7]王昊.电能计量装置状态检查技术的研究[D].华北电力大学（河北）,电气工程,2004,硕士.
[8]赵健.典型加载路径的超塑性自由胀形数值模拟研究[D].吉林大学,材料加工工程,2014,硕士.
[9]许娟.集资诈骗罪研究[D].南京大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[10]祁宏伟.文学伦理学批评视阈下的利蓓加·夏普的形象分析[D].河北师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[11]马克明,祖元刚.植被格局的分形特征[J].植物生态学报,2000,01:111-117.
[12]韩淑园.高中政治课堂中师生互动存在的问题及对策研究[D].华中师范大学,教育,2013,硕士.
[13]陈蒙伟.配电网动态无功广域在线控制的研究[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[14]张春阁.我国证券营销人员激励问题研究—以KH证券公司为例[D].石家庄经济学院,企业管理,2013,硕士.
[15]严又生.井间地震测量共炮点道集[J].石油地球物理勘探,1998,02:285.
[16]李仲彩.探究式教学模式在羽毛球技术教学中的实验研究[D].云南师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[17]赵耀.AB银行住房贷款客户需求偏好研究[D].吉林大学,高级管理人员工商管理,2012,硕士.
[18]宁玉玲.基于DSP-ARM的便携式电能表现场检验仪的研制[D].南昌航空大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[19]高先燕.职教硕士教育质量保障体系研究[D].广东技术师范学院,职业技术教育学,2013,硕士.
[20]任梅.胞内分枝杆菌HSP65基因和HSP70基因的克隆及原核表达[D].吉林农业大学,预防兽医学,2012,硕士.
[21]金福海,王小莉.铁路独柱支撑预应力曲线桥车桥系统振动分析[J].中外建筑.2002(05)
[22]石光.智能与节能养老住宅监控系统研究与设计[D].西安建筑科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[23]张敏.网络课件的多粒度信息提取[D].重庆大学,计算机软件与理论,2003,硕士.
[24]王珍玲.基于石墨烯复合物的AChE生物传感器用于有机磷的检测[D].河南工业大学,2012.
[25]邵清.丙型肝炎病毒NS3结合蛋白和NS3反式激活新靶基因NS3TP6的研究[D].第四军医大学,内科学,2004,硕士.
[26]陈珍珍.郑州市惠济区城乡结合部中小学教育设施空间配置评价与优化[D].湖南师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[27]喻龙.太极拳桩功中“升降桩”的运动学特征分析[D].北京体育大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[28]张肖肖.月经性偏头痛患者的静息态功能磁共振研究[D].河北医科大学,神经病学（专业学位）,2014,硕士.
[29]周忠彬.基于oracle数据仓库技术构建医院统计资源库[D].第四军医大学,流行病与卫生统计学,2004,硕士.
[30]李勇.基于RFID技术的电视台设备管理系统设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[31]袁峰.高校人事管理信息系统分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[32]李清东.火箭故检系统故障诊断专家系统设计与实现[D].西北工业大学,武器系统与运用工程,2004,硕士.
[33]毛振鹏.中国鲍养殖产业结构与特征研究[D].中国海洋大学,渔业经济与管理,2014,博士.
[34]严鸥鹏.大推力速燃单兵火箭发动机关键技术研究[D].国防科学技术大学,航天工程,2012,硕士.
[35]鲍楠.非营利组织税收征管法律制度研究[D].天津财经大学,经济法学,2012,硕士.
[36]冯艳.全面小康进程中的消费结构变化与产业结构调整[D].湖南师范大学,产业经济学,2014,硕士.
[37]陈星宇.L2TP技术在VPN中的研究与实现[D].中国地质大学（北京）,电子与通信工程,2013,硕士.
[38]才凡.锦州市凌河区公务员激励机制研究[D].东北大学,公共管理,2009,硕士.
[39]范超.闽东穿斗式大木结构分类与选型[D].华侨大学,建筑历史及其理论,2013,硕士.
[40]张柯.数字音频设备的控制及嵌入式网络模块的设计与实现[D].西安电子科技大学,电路与系统,2010,硕士.
[41]权恩雷.齐鲁石化公司醇类产品电子商务营销方案研究[D].大连理工大学,工商管理,2004,硕士.
[42]马希璐.含低交联PAMAM树形大分子硅胶基吸附材料的制备及性能研究[D].鲁东大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[43]王云宜.微型机汉字信息处理系统在生产计划、调度中的应用[J].冶金自动化,1985,05:40-45+64.
[44]闫敏.3MW试验系统冷却塔群控与策略研究[D].华中科技大学,热能工程,2012,硕士.
[45]蒙秀锋.广西贺州市农户选择农作物新品种的决策因素分析[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[46]卢雪琴.网络教育环境下个性化教学模型的研究[D].浙江工业大学,2012.
[47]余平章,刘启宏,李继学.高温炉渣粘度计微型机控制系统[J].冶金自动化,1984,04:28-33.
[48]樊雪松.数字散斑相关方法的研究[D].天津大学,固体力学,2004,硕士.
[49]杨忠杰.株洲四水厂净水工程招标研究[D].西南交通大学,工商管理,2003,硕士.
[50]钟玲玲.基于情景和数字化预案的城轨应急决策方法研究[D].北京交通大学,2014.