四环素调控的干扰TLR4受体的慢病毒抑制坐骨神经结扎大鼠的伤害性刺激的研究

【摘要】神经病理性疼痛，由外周神经，背根神经节，脊髓或中枢神经系统的损伤引起，其特征是痛觉过敏、异常性疼痛及自发性疼痛。神经病理性疼痛的治疗依旧是个难题目前，临床主要用阿片类止痛药物治疗，但其效果有限且副作用较多，这对患者的生活带来了很大的困扰。外周神经损伤以后，脊髓背角神经胶质细胞的激活在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥了重要作用。Toll样受体4（TLR4）是一种模式识别受体，参与了胶质细胞的激活，是使中枢敏化导致疼痛的一个重要蛋白。然而，目前尚未有针对TLR4蛋白的可利用的抑制剂。RNA干扰技术为基因功能的研究提供了可靠的途径。由慢病毒介导的RNA干扰技术已被批准用于人类研究。长期的基因下调可以通过利用慢病毒携带小发夹RNA(shRNA)导入受感染细胞来实现,shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。在本研究中我们构建携带TLR4小发夹RNA的慢病毒，经鞘内注射进入蛛网膜下腔，拟达到治疗大鼠神经病理性疼痛的目的。为了防止慢病毒对体内TLR4蛋白的过度抑制而产生副作用，我们对慢病毒加入了四环素tet-on调控系统。用四环素类似物强力霉素来启动慢病毒的表达。大鼠的神经病理性疼痛模型由结扎右侧坐骨神经（CCI）来构建。慢病毒是通过鞘内置管给予,强力霉素溶于动物饮用水中通过口服的方式给予。该研究分为两个部分：1.四环素可调控的干扰TLR4蛋白的慢病毒包装与构建。2.鞘内注射慢病毒LvOn-siTLR4对坐骨神经结扎的大鼠热痛阈和机械痛阈的影响，此部分实验将SD雄性大鼠分为6组，每组7只。分别为:sham组（假手术大鼠鞘内注射生理盐水）；CCI组（CCI大鼠鞘内注射生理盐水）；CCI+LvOn-siTLR4+DOX组（CCI+鞘内注射LvOn-siTLR4+口服强力霉素）；CCI+LvOn-siTLR4组（CCI+鞘内注射LvOn-siTLR4）CCI+Lv-mismatchsiRNA（CCI+携带错配序列的慢病毒）；CCI+DOX组（CCI+鞘内注射生理盐水+口服强力霉素）。坐骨神经结扎手术和鞘内注射慢病毒在一次麻醉中先后实施。通过测量大鼠的机械痛阈和热痛阈来评估慢病毒对大鼠疼痛的影响。术后第7天处死大鼠取脊髓腰膨大节段，分别用RT-PCR技术及western-blot分析TLR4mRNA的表达及蛋白表达的情况。主要研究结果如下：1.四环素可调控的携带TLR4shRNA的慢病毒成功构建并完成滴度测定，体外转染成功。2.①与假手术组相比，CCI组的大鼠机械刺激痛和热刺激痛阈值明显降低（P＜0.05），脊髓腰L4-L6节段TLR4的mRNA及蛋白表达升高（P＜0.05）。②在坐骨神经结扎后的第3，5，7天，LvOn-siTLR4+DOX组的大鼠机械痛阈与热痛阈值比CCI组、Lv-mismatchsiRNA组及CCI+DOX组相比有明显的升高（P＜0.05），脊髓腰膨大TLR4mRNA及蛋白的表达降低。③CCI组与CCI+DOX组相比，大鼠机械痛阈值与热刺激痛阈值无明显差异（P>0.05）,脊髓腰膨大TLR4mRNA表达及蛋白表达无明显差异（P>0.05）.结论：1.四环素可调控的携带TLR4小干扰RNA的慢病毒成功构建。2.在CCI大鼠鞘内注射可调控的干扰TLR4受体的慢病毒可以缓解大鼠的神经病理性疼痛，大鼠服用强力霉素后热痛阈和机械痛阈升高，脊髓TLR4蛋白的表达量明显降低。
【作者】潘瑞瑞；
【导师】俞卫锋；
【作者基本信息】苏州大学，麻醉学（专业学位），2014，硕士
【关键词】神经病理性疼痛；慢病毒Toll样受体4；镇痛；四环素；坐骨神经结扎；

【参考文献】
[1]范斌,张粒子.华东二期电力市场建设初步设想[J].电力系统自动化,2009,11:104-107.
[2]张楠.基于费氏三维模型的批评性话语分析[D].首都师范大学,德语语言文学,2014,硕士.
[3]陈国庆.知识观的现代转变与语文基础教育改革[D].贵州师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[4]王翔.“过程写作法”运用于高中英语写作教学的一项行动研究[D].首都师范大学,2004,硕士.
[5]张玲玉.我国生物医药产业自主创新能力研究[D].华中科技大学,产业经济学,2012,硕士.
[6]张秦怡,唐水花,张洁,黄朋肖,李星.超级电容器复合电极材料Ni(OH)_2/石墨烯的研究进展[J].电子元件与材料,2013,12:1-7.
[7]喻纯诚,王福田.构筑物抗震技术[J].工程抗震.1986(02)
[8]魏运磊.山东泰工工程有限公司竞争战略研究[D].山东理工大学,工商管理,2013,硕士.
[9]李钦军.基于低碳经济背景下广州市新能源汽车产业发展政策研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[10]仵宗礼.我国会计师事务所内部治理研究[D].西南大学,会计学,2013,硕士.
[11]缪伟.露天矿抛掷爆破—单斗卡车工艺关键技术研究[D].内蒙古科技大学,采矿工程,2014,硕士.
[12]蔡国伟,孔令国,薛宇,孙佰仲.风氢耦合发电技术研究综述[J].电力系统自动化,2014,21:127-135.
[13]李碧君,徐泰山,薛禹胜,尹玉君,郑亮.大电网安全稳定综合协调防御系统的工程设计方法[J].电力系统自动化,2009,23:90-93+102.
[14]符加方.市级国土资源“一张图”及核心数据库研究与设计[D].南京农业大学,公共管理,2012,硕士.
[15]姚京京,徐常青.最大度为３或４的图的邻和可区别全染色[J].山东大学学报(理学版),2015,02:.
[16]朱峰.多尺度视角下的石化企业信息集成研究[D].浙江大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[17]王夕萌.Teradata数据仓库在邮政金融客户管理系统中的设计与实现[D].北京交通大学,2013.
[18]吕晓蓓.《联合国反腐败公约》对我国职务犯罪预防的启示[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[19]何志东,彭世辂.谐波产生的危害和消除措施[J].大众用电.2002(09)
[20]张楠.内部雇主品牌与员工绩效的关系研究[D].首都经济贸易大学,劳动经济学,2014,硕士.
[21]尉玮.基于人力资本投资理论的企业大学运作模式与发展趋势探析[D].北京交通大学,2010.
[22]谢瑞华,沈宗珍,刘波.一种结构紧凑的正交模耦合器[J].空间电子技术.1997(03)
[23]陈业娜.用于CO优先氧化的CuO/Co_3O_4-CeO_2三元氧化物催化剂研究[D].天津大学,工业催化,2013,硕士.
[24]刘欢欢.我国上市商业银行盈利能力及其影响因素研究[D].南京航空航天大学,金融学,2014,硕士.
[25]胡劲松,周方洁,鲍吉龙,骆再飞.基于模糊隶属函数的变压器色谱峰定性算法[J].电力系统自动化,2005,18:70-72+84.
[26]李君.安徽省农村信息化发展研究[D].安徽大学,情报学,2013,硕士.
[27]程洪博.松果体区蛛网膜结构的显微解剖与临床研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[28]黄涛.下游应用是石墨烯产业化关键[N].中华工商时报,2014-08-13002.
[29]杨丽龙,张淑玲,郭云亮,王宇瑶,王贵宾.两步还原法制备聚醚醚酮/石墨烯导电复合材料[A].中国化学会高分子学科委员会.2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题L：高性能树脂[C].中国化学会高分子学科委员会:,2013:1.
[30]罗彩连.省网日到煤量预测与高压电网系统仿真[D].华中科技大学,系统工程,2013,硕士.
[31]李景虹.石墨烯的电分析化学研究[A].中国材料研究学会.2011中国材料研讨会论文摘要集[C].中国材料研究学会:,2011:2.
[32]王毅全.第三人侵权时经营者的安全保障义务探析[D].西南政法大学,民商法（专业学位）,2012,硕士.
[33]袁云云.西瓜噬酸菌遗传操作系统的建立及选择性培养基的研制[D].南京农业大学,植物病理学,2013,硕士.
[34]吴祥松.聚合物薄膜共混体系相行为的Monte Carlo模拟研究[D].安徽大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[35]蔡锐.湖南高考英语测试对英语口语教学的反拨作用实证研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[36]何耀,张陈斌,刘兴涛,陈宗海.基于信息融合的LiFePO_4动力电池组SOC估计[J].控制与决策,2014,01:188-192.
[37]赵连胜,行飞.数据挖掘的任务、对象和方法[J].内蒙古大学学报(自然科学版),2002,02:236-240.
[38]马世勇.中信戴卡宁波轮毂制造有限公司发展战略研究[D].燕山大学,工商管理,2013,硕士.
[39]卿湘东.高维化学计量学方法及其在土壤与水体分析中的应用研究[D].湖南大学,分析化学,2014,博士.
[40]何沙沙.城乡义务教育财力资源的配置失衡问题与对策[D].河北大学,教育学原理,2014,硕士.
[41]崔琴.抽逃出资股权转让的法律问题研究[D].西南政法大学,民商法（专业学位）,2012,硕士.
[42]钱尊岩.低空无人机遥感在油田测量中的关键技术应用研究[D].中国石油大学（华东）,测绘工程,2012,硕士.
[43]薛琳.Fe(Co)NbBCu纳米晶合金软磁性能及微观结构研究[D].中国矿业大学,光学,2014,硕士.
[44]李雪梅.中国中小企业集群竞争优势分析[D].东北财经大学,产业经济学,2003,硕士.
[45]叶莲娜（KUZMINYKHELENA）.俄罗斯港口至2030年的基础设施发展战略研究[D].大连海事大学,交通运输规划与管理,2014,硕士.
[46]贺纯佩,李思经.农业本体论——农业知识组织系统的建立[J].农业图书情报学刊,2004,10:41-44.
[47]余思阳.光突发传送网关键技术的研究[D].北京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[48]朱江.论中国特色社会主义法治的实现机制[D].中央民族大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2004,硕士.
[49]乔瑞军.客运专线车站接发车进路选择与调整问题研究[D].北京交通大学,2012.
[50]韩玲玲.大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化及对小鼠胰腺氧自由基水平的影响[D].吉林农业大学,农产品加工及贮藏工程,2012,硕士.