霉酚酸酯对糖尿病大鼠足细胞肥大及凋亡的影响及机制研究

霉酚酸酯对糖尿病大鼠足细胞肥大及凋亡的影响及机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-03 分类:期刊论文 喜欢:1577
师大云端图书馆

【摘要】研究目的糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)以早期肾脏体积增大、晚期肾小球硬化为主要特征,肾脏细胞的增殖、肥大与凋亡参与了DN的发生、发展。本研究采用体内动物实验和体外细胞培养相结合的方法,通过观察糖尿病大鼠及高糖刺激下的肾小球足细胞肥大、凋亡状态,测定细胞周期蛋白激酶抑制剂(cyclin-kinaseinhibitors,CKIs)p27kip1、p21cipt及凋亡相关基因bcl-2、bax、cleavedcaspase-3的表达,观察霉酚酸酯(mycophenolatemofetil,MMF)对足细胞肥大、凋亡的影响,为治疗DN提供科学的理论依据。研究方法体内动物实验:32只雄性健康Wistar大鼠,腹腔内注射链脲佐菌素(STZ),另外8只作为对照组(NC)。注射STZ72小时后剪尾采血,测血糖>16.7mmol/L,尿糖阳性,表明糖尿病模型成功建立。将糖尿病造模成功的32只大鼠,随机分为糖尿病组(DM)、霉酚酸酯组(DM+M)、缬沙坦组(DM+V)及霉酚酸酯+缬沙坦联合治疗组(DM+M.V),每组8只。成模2天后,治疗组分别给予MMF15mg.kg-1.d-1,缬沙坦40mg.kg-1.-1,联合治疗给予MMF15mg.kg-1.d-1+缬沙坦40mg.kg-1.d-1,1mg/d灌胃;而NC组和DM组每日予等量溶媒灌胃,共16周(w)。分别检测五组大鼠4w、8w及16w的左肾重/体重、血糖、血压、内生肌酐清除率及24小时尿蛋白排泄量;光学显微镜和电子显微镜观察糖尿病大鼠肾组织形态学的变化;免疫组织化学法检测肾皮质nephrin.WT1蛋白的表达;TUNEL法检测足细胞的凋亡率;Western-blot半定量及荧光实时定量PCR的分析方法,检测肾组织中p27kip1、p21cipt及bcl-2.bax.cleavedcaspase-3的表达。体外细胞实验:订购的小鼠肾足细胞,按培养液中葡萄糖、霉酚酸(mycophenolicacid,MPA).缬沙坦的含量不同分为:①正常对照组NG(葡萄糖浓度5.6mmol/L+2.5%FBS的DMEM);②高糖组HG(葡萄糖浓度25mmol/L);③HG+M组:HG(葡萄糖浓度25mmol/L)+MPA2.5×10-7mol/L;④HG+V组:HG(葡萄糖浓度25mmol/L)+缬沙坦10-7mol/L;作用72小时(h)。采用流式细胞仪测定12h、24h、48h、72h各时间点足细胞的肥大指数及凋亡率,运用Western-blot半定量及荧光实时定量PCR的分析方法,检测肾小球足细胞中p27kip1、p21cip1及bcl-2、bax、cleavedcaspase-3的表达。结果1.临床参数与NC组比较,DM大鼠血糖明显升高、体重减轻、肥大指数增加,24小时尿蛋白排泄量及肌酐清除率均明显增高(P<0.01)。16周末,DM大鼠肾重/体重指数较NC组明显升高(8.49±1.21vs4.57±0.82,P<0.01);而霉酚酸酯和/或缬沙坦治疗16w后,肾重/体重指数明显降低,差异有显著性(P<O.01);但各药物治疗组间无统计学意义(P>0.05)。16w末,DM大鼠尿蛋白量较NC组明显升高(55.37±2.33vs10.52±0.66,P<0.05);同样药物治疗16w后,24小时尿蛋白排泄量明显降低,差异有显著性(P<0.01);各给药组间无统计学差异(P>0.05)。2.肾脏组织形态学观察光镜:4周前糖尿病大鼠无明显变化。此后,随着实验周期的延长,糖尿病大鼠肾小球的体积逐渐增大、系膜区逐渐增宽,且基底膜增厚、毛细血管腔受压、变窄;与NC组比较,16周末DM组肾小球的硬化指数(1.15±0.12vs0.15±0.05,P<0.01)及间质纤维化积分(0.58±0.08vs0.12±0.04,P<0.01)明显增加,其差异有显著性;各药物治疗组较DM组均有不同程度的改善。电镜:糖尿病大鼠肾小球毛细血管基底膜均质性增厚和系膜基质增多,伴足细胞足突的广泛融合,并可见裸露的基底膜及脱落的足细胞。MMF和/或缬沙坦治疗后,足突的融合减轻,系膜基质及足细胞的脱落均明显减少。3.肾组织中nephrin、WT-1蛋白及mRNA的表达免疫组织化学染色显示:正常大鼠nephrin、WT1沿肾小球基底膜呈棕黑色线形分布,而糖尿病大鼠的线样沉积变淡、变细、甚至消失,经MMF和/或缬沙坦治疗后,其线样沉积又恢复至粗线状。从第4周开始糖尿病组大鼠肾组织中nephrin蛋白(2.08±0.42vs2.63±0.51,P<0.05)及WT1蛋白(1.26±0.2vs1.59±0.26,P<0.05)的表达减少,且随着时间的推移nephrin、WT1蛋白的表达进一步降低。各治疗组与DM组比较,nephrin、WT1的表达均有不同程度的升高(P<0.05);且16w末nephrin蛋白的表达DM+M组(1.83±0.43)及DM+M.V组(1.75±0.31)疗效优于DM+V组(1.39±0.28),有显著性差异(P<0.05);而各药物治疗组间WT1蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。从第4周开始DM组大鼠肾组织中nephrinmRNA(0.87±0.13vs0.95±0.091,P<0.05)、WT1mRNA(0.92±0.095vs1.04±0.079,P<0.05)的表达下降,且随着时间的推移其mRNA的表达进一步降低。而经霉酚酸酯和/或缬沙坦治疗后,nephrin、WT1mRNA的表达均有不同程度的上调(P<0.05),16周末WT1mRNA的表达霉酚酸酯联合治疗组(1.30±0.25)优于缬沙坦组(1.04±0.23),(P<0.05),而nephrinmRNA的表达三治疗组间比较无明显差异(P>0.05)。4.足细胞肥大指数高糖组足细胞肥大从24小时开始(0.828±0.23vs0.678±0.16,P<0.05),且随着时间的推移足细胞进一步肥大。各治疗组与高糖组比较,霉酚酸治疗组足细胞肥大从24小时开始减轻,而缬沙坦治疗组从48小时开始明显减轻,且随着时间推移,疗效逐渐增强(P<0.05)。5.p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表达体内动物实验:从第4周开始DM组大鼠肾组织中p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表达增强,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05),16周末达高峰。各治疗组与DM组比较,p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表达从第8周开始降低(P<0.05),且随着实验周期的延长,p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表达进一步降低;16w末p27kipl蛋白、mRNA及p21cip1mRNA的表达,霉酚酸酯+缬沙坦联合治疗组优于缬沙坦组(P<0.05)。体外足细胞培养:p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表达:从24小时开始,HG组小鼠足细胞p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA水平开始升高,与NG组相比差异有显著性(P<0.05)。且随着时间的推移,p27kipl和p21cipl蛋白及mRNA的表达进一步升高。霉酚酸及缬沙坦可明显降低p27kip1和p21cip1蛋白的表达,且72小时末p27kip1蛋白的表达霉酚酸的疗效优于缬沙坦(P<0.05);霉酚酸和缬沙坦亦可明显降低p27kip1mRNA的表达,而p21cip1mRNA的表达仅霉酚酸起到明显的抑制作用。6.足细胞凋亡率体内动物实验:实验第8周糖尿病大鼠足细胞凋亡率开始增高(2.63±0.31vs0.84±0.26,P<0.01),且随着实验的延长,足细胞凋亡率进一步增高。各治疗组与DM组相比,均有不同程度的下降;16周末霉酚酸酯单一治疗组(1.81±0.27)及联合治疗组(1.24±0.19)优于缬沙坦组(2.25±0.33),差异有显著性(P<0.05)。体外足细胞实验:高糖培养48小时后,足细胞凋亡率明显高于NG组(4.97±0.58vs2.77±0.31,P<0.05)。两治疗组,仅霉酚酸治疗72小时后足细胞凋亡率降低(P<0.05),而缬沙坦治疗组无变化(P>0.05),且72小时末霉酚酸的疗效优于缬沙坦,差异有统计学意义(P<0.05)。7.bax、bcl-2、cleavedcaspase-3蛋白及mRNA的表达体内动物实验:糖尿病大鼠的bax、cleavedcaspase-3蛋白及mRNA的表达从实验第8周起明显升高,而bcl-2的表达下降,差异有显著性(P<0.05)。各治疗组与DM组比较,其表达均有不同程度的改善;且16周末bax/bcl-2蛋白的表达,DM+M组(1.42±0.2)、DM+M.V组(1.57±0.26)与DM+V(1.95±0.24)比较差异有显著性,(P<0.01)。体外足细胞培养:高糖培养下,足细胞的bax、cleavedcaspase-3蛋白及mRNA的表达从实验第48小时起升高,而bcl-2的表达下降,差异有显著性(P<0.05),且随着时间的推移比值进一步升高。经霉酚酸或缬沙坦治疗后,其比值较HG组下降,差异有显著性(P<0.01);且72小时末bax/bcl-2、cleavedcaspase-3蛋白的表达,HG+M组较HG+V组明显降低,差异有显著性(P<0.05)。结论:1.足细胞的肥大与凋亡参与了糖尿病肾病的发生、发展。糖尿病早期,足细胞的肥大伴随着细胞周期蛋白激酶抑制剂p27kip1、p2cip1表达的增高。随着糖尿病病程的进展,足细胞的凋亡率增高,晚期的肾小球硬化与其过度凋亡有关,并伴随着凋亡相关基因bax、cleavedcaspase-3表达的升高及bc1-2表达的降低。2.霉酚酸酯和缬沙坦可有效的抑制肾小球足细胞的肥大与凋亡,调节细胞周期相关蛋白(p27kip1、p21cip1)和凋亡相关基因(bax、bcl-2、cleavedcaspase-3)的表达,起到一定的保护作用。因此,推测霉酚酸酯可能通过调节细胞周期负性调控蛋白p27kip1、p21cip及凋亡相关基因bax、bcl-2及cleavedcaspase-3的表达,抑制和阻断肾小球足细胞的肥大与凋亡,从而起到降低蛋白尿、延缓糖尿病肾病进展的作用。
【作者】吕伟;
【导师】关广聚;
【作者基本信息】山东大学,内科学(专业学位),2014,博士
【关键词】霉酚酸酯;糖尿病肾病;足细胞;肥大;凋亡;

【参考文献】
[1]张蕊.IBDV感染SPF雏鸡局部黏膜TGF_(β1) mRNA表达及免疫功能的变化[D].东北农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[2]原鑫.稻水象甲适生性相关基因研究[D].浙江大学,农业昆虫与害虫防治,2014,博士.
[3]韦程寿.血管内皮生长因子抗体抑制骨肉瘤生长及血管生成的实验研究[D].广西医科大学,骨外科学,2004,硕士.
[4]周碧霞.车钩连接轴探伤电弧损伤后安全性分析及工艺改进研究[D].华南理工大学,机械工程,2012,硕士.
[5]刘寅.建设工程项目的合同管理研究[D].北京交通大学,2008.
[6]杨月辉.车联网路侧单元动态联盟形成算法研究[D].大连理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[7]方益.水产加工品中胆固醇氧化物含量检测及形成机理研究[D].浙江海洋学院,食品加工与安全(专业学位),2014,硕士.
[8]易仁萍,陈耿,杨明,孙志辉.数据挖掘技术及其在审计风险管理中的应用[J].审计与经济研究,2003,01:3-6.
[9]毛司理.天然气制甲醇生产工艺优化[D].大连理工大学,化学工程(专业学位),2012,硕士.
[10]赵刚.敏捷供需链管理及其供应商评价体系研究[D].南京航空航天大学,2003.
[11]龚薇薇.INOSINE对脑缺血再灌流后脑组织CyclinD1、CDK4表达的影响[D].青岛大学,神经病学,2004,硕士.
[12]刘允.高校辅导员绩效评估指标体系研究[D].杭州电子科技大学,思想政治教育,2013,硕士.
[13]郑亮.基于DM8168多路视频监控系统研制[D].杭州电子科技大学,电路与系统,2014,硕士.
[14]丁莉芸.放电等离子烧结技术制备Ti-Mg系合金的研究[D].武汉理工大学,材料加工工程,2004,硕士.
[15]冯华.基于WorldFIP现场总线协议的智能模块——现场总线网关的开发[D].华北电力大学(北京),控制理论与控制工程,2004,硕士.
[16]马征.氮掺杂碳纳米材料的制备及其催化应用[D].苏州大学,2013.
[17]王克朝1,2,王甜甜2,苏小红2,马培军2.基于频繁闭合序列模式挖掘的学生程序雷同检测[J].吉林大学学报(工学版).
[18]何玉杰.功能性权利要求研究[D].北京化工大学,民商法学,2013,硕士.
[19]董沙路.中国在美上市公司内部控制效果及影响因素实证研究[D].石家庄经济学院,会计学,2014,硕士.
[20]李亭颖.防水保温轻质高强石膏板制备技术[D].浙江大学,环境工程(专业学位),2013,硕士.
[21]肖跃军.室内景观设计艺术研究[D].中南林业科技大学,林业,2013,硕士.
[22]李相阳.无线传感器网络分簇算法及路由协议研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[23]张珂珂.飞行器耦合机理及耦合补偿研究[D].华中科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[24]张海波,李增楠,孙玉伟,郑志勤.基于层次分析模型的同调机群自动识别方法[J].电力系统自动化,2015,10:81-86+116.
[25]王璟,尚兴记,张增明,谢荣艳,胡勇,丁雨田.染料敏化太阳能电池新型对电极材料研究进展[J].材料导报,2014,11:14-21+26.
[26]王敏.个性化搜索中隐私保护的问题研究[D].河北工程大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[27]李盼.融入直方图相交核的局部稀疏编码图像分类算法研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2014,硕士.
[28]路永新.钢的辅助热源搅拌摩擦焊工艺及温度场检测与模拟[D].兰州理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[29]李淑君.保险受益权丧失规则研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[30]刘玉娜.第三届亚洲沙滩运动会背景下山东省海阳市体育旅游资源开发研究[D].新疆师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[31]袁琳.土地营销的区域评价体系研究[D].华侨大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[32]袁杰.铁观音香气化学成分及活性研究[D].华侨大学,化学工程,2014,硕士.
[33]杨焕成.金属原子修饰的硅烷、锗烷的第一性原理研究[D].河北师范大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[34]王玉梅,郭浩,惠胜达.基于残流增量法的谐振接地系统故障定位方法[J].电力系统自动化,2011,02:62-65+92.
[35]陈雄川.武穴市农村文化传承与发展[D].华中师范大学,农业推广(专业学位),2014,硕士.
[36]李沛哲.黄自艺术歌曲二度创作的研究[D].天津音乐学院,音乐表演,2013,硕士.
[37]朱玉全,孙志挥,赵传申.快速更新频繁项集[J].计算机研究与发展,2003,01:94-99.
[38]燕蜻a,梁吉业b,宋鹏a.一种基于相容关系的群体共识达成方法[J].控制与决策.
[39]李可.浅析当代都市水墨人物画的意象表现[D].西安美术学院,美术学,2014,硕士.
[40]李继伟.梯级水库群多目标优化调度与决策方法研究[D].华北电力大学,管理科学与工程,2014,博士.
[41]石峻玮.解析美国动画电影中的中国背景元素[D].吉林大学,设计艺术学,2013,硕士.
[42]何桂萍.海上保险法近因原则研究[D].大连海事大学,法律,2013,硕士.
[43]陈瑜.论商标先用权的法律保护[D].河北经贸大学,法律,2014,硕士.
[44]王若茵.字频与任务形式对汉字情绪启动效应的影响[D].河北大学,基础心理学,2014,硕士.
[45]张小亮.钙离子有机—矿质复合体对三氯乙烯的吸附实验研究[D].中国地质大学(北京),地下水科学与工程,2013,硕士.
[46]韩娜娜.喀什维吾尔族传统花帽艺术研究[D].新疆师范大学,美术学,2013,硕士.
[47]赤常春.企业员工不安全行为研究及防范对策[D].南华大学,安全工程,2012,硕士.
[48]吕宵楠.劳务派遣制度的经济分析[D].中国政法大学,法律与经济,2013,硕士.
[49]赵金兰.刁泉矿山人员定位系统的设计研究[D].太原科技大学,控制工程,2013,硕士.
[50]王乾乾,王全杰.氧化石墨烯对聚氨酯微孔膜的改性研究[J].中国皮革,2012,13:1-5.

相关推荐
更多