林蛙皮多肽提取工艺的建立及其对HaCaT细胞作用的研究

【摘要】多肽具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种活性。部分多肽与皮肤细胞的增殖有关，能提供皮肤养分，延缓皮肤衰老，促进皮肤创面修复，具有重要的应用价值和开发潜力。林蛙皮腺内含多肽类因子、保湿因子等多种活性物质，林蛙皮多肽以其抗菌、抗病毒活性而备受研究者青睐。本实验采用酸浸提法、中性蛋白酶水解法分步提取林蛙皮多肽，以多肽得率为指标，分别进行单因素、L9（34）正交实验，得出酸浸提林蛙皮多肽液的最佳工艺：4℃条件下，pH3.5的HAc-NaAc缓冲溶液、料液比1:30、浸提时间12h；酶解法提取林蛙皮多肽液的最佳工艺：料液比：1:2，温度55℃、pH6.5、时间2h、加酶量1000U/g。在最优工艺下，分别将反应体系放大1000倍。酸浸提多肽粗提液，用膜分离技术分级分离，得到纳滤浓缩液进行真空冷冻干燥，制得林蛙皮酸浸提多肽APR（Acidolysis-polypeptidesfromskinofRana）冻干粉；然后将酸浸提后的残渣及超滤浓缩液，利用优化的酶解条件制备酶解多肽粗提液，膜分离技术分级分离得到纳滤浓缩液，真空冷冻干燥制得林蛙皮酶解多肽EPR（Enzymolysis-polypeptidesfromskinofRana）冻干粉。检测APR和EPR干粉的理化性质，结果显示，在220nm处有多肽的紫外特征吸收峰、傅里叶红外光谱检测有多肽的特征官能团、高效凝胶过滤测得多肽相对分子量范围为190Da~1000Da。表明成功制备两种林蛙皮多肽干粉。MTS法检测APR和EPR对HaCaT细胞的增殖作用，结果显示，当APR和EPR在800mg/L、1600mg/L浓度时（后文用APR800、EPR800表示）对HaCaT细胞增殖均有促进作用（p<0.001）。实时荧光定量PCR分析HaCaT细胞表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）mRNA的相对表达量，与空白对照组相比APR800、EPR800作用的HaCaT细胞EGFmRNA的相对表达量分别升高0.24倍（p<0.05）、0.4倍（p<0.001）。Westernblotting检测HaCaT细胞EGF蛋白的表达水平，与空白对照组相比APR800、EPR800作用的HaCaT细胞EGF蛋白的相对表达量分别升高1.1倍（p<0.05）、1.48倍（p<0.01），表明林蛙皮多肽促进HaCaT细胞的增殖与细胞EGF蛋白质表达量的增加有关。检测APR、EPR对HaCaT细胞中CAT、SOD、Hyp、MDA和T-AOC含量的影响，结果显示，与空白对照组相比，实验组CAT、SOD、Hyp含量和总抗氧化能力T-AOC升高（p<0.001），丙二醛含量下降（p<0.05）；表明APR、EPR均具有抗氧化活性。流式细胞术-AnnexinV-FITC/PI双染法检测APR、EPR对HaCaT细胞凋亡（率）的影响，结果显示，APR800、EPR800作用后的HaCaT细胞凋亡率分别降低2.3%（p<0.001）、1.3%（p<0.001），且正常细胞百分率增大。荧光定量PCR和Westernblotting检测HaCaT细胞中半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cysteinylaspartatespecificproteinase-3，Caspase-3）mRNA和蛋白质的相对表达量，结果显示，APR800和EPR800作用的HaCaT细胞Caspase-3mRNA的相对表达量分别下降2.5倍（p<0.05）、4.9倍（p<0.001）；Caspase-3蛋白质的相对表达量分别降低1.4倍（p<0.01）、1.2倍（p<0.01），表明林蛙皮多肽能抑制HaCaT细胞的凋亡，且与Caspase-3凋亡途径有关。本研究利用酸浸提工艺，保留了林蛙皮多肽特有的活性；酶水解工艺将酸浸提残渣内的大分子蛋白酶解成多肽。膜分离技术、真空冷冻干燥技术最大限度保留了多肽的活性，且规模易于放大。同时初步探究APR、EPR对HaCaT细胞增殖、凋亡的作用及机制，为研究林蛙皮多肽对皮肤细胞的作用奠定理论基础。
【作者】张鑫；
【导师】刘松财；
【作者基本信息】吉林大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】林蛙皮多肽；提取工艺；HaCaT细胞；细胞增殖；细胞凋亡；

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