微小RNA-1通过调节基因KCNE1和KCNB2的表达促进快速起搏兔心房电重构的研究

微小RNA-1通过调节基因KCNE1和KCNB2的表达促进快速起搏兔心房电重构的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-30 分类:期刊论文 喜欢:1922
师大云端图书馆

【摘要】研究背景心房颤动(房颤AF)是指心房活动不协调,导致规则有序的心房电机械功能恶化,在心电图上的表现为P波消失,代之以不规则的基线波动,心室率极不规则,是最严重的心房电活动紊乱之一,具有较高的致病率、致残率,并导致了沉重的社会经济负担。无序的颤动使心房泵血功能丧失或恶化,加之房室结对快速无序的心房激动的递减传导,可引起心室极不规则的兴奋,心房收缩力丧失,血流瘀滞易形成栓子。因此心功能受损、心室率(律)紊乱、心房附壁血栓形成等是AF患者的主要病理生理特点。过去很多实验室或临床研究已经表明,心房电重构(ER)和结构重构(SR)是发生AF的两大主要机制。心房ER主要包括心房有效不应期(AERP)及动作电位时程的缩短,动作电位传导速度减慢,是AF或快速心房率所产生的有利于AF维持和发生的心房电生理特性的改变。ER发生在AF过程的较早期,而SR发生的相对较晚。近来对编码特异离子通道蛋白基因的mRNA表达异常的研究引起了越来越多的关注,它可以引起离子通道蛋白数量、结构、性质的改变,尤其是钾离子通道,从而成为ER和心律失常的潜在分子机制。其中转录后水平对mRNA的调节也成为了人们关注的焦点。目前药物依然是AF治疗的重要方法,药物能恢复和维持窦性心律,控制心室率。但是药物治疗的副作用较多如恶心、头晕、疲劳甚至室性心律失常。AF的非药物治疗包括电转复、射频消融治疗和外科迷宫手术治疗。电复律是指用两个电极片放置在病人胸部的适当部位,通过除颤仪发放电流,重新恢复窦性心律的方法。电复律不是一种根治AF的方法,AF往往会复发,而且部分患者仍需要继续服用抗心律失常药物维持窦性心律。导管消融治疗及外科迷宫手术都属于有创治疗,易并发感染及血栓形成等。因此,要找到一个高效、安全的新策略用于治疗AF是非常重要的。MicroRNA(miRNA)是小RNA中的一个大家族,最早是Lee等人在线虫中发现,其在果蝇、植物和哺乳动物等真核生物中均有所发现。因为它在动植物体内发挥着重要且广泛的调控作用,日渐成为人们新的研究热点。miRNA为一类内源性非编码的单链小RNA,通过与其5’端“种子序列”与目的基因mRNA的3’非翻译区完全或不完全性互补配对,对目的基因mRNA的碱基进行切割或抑制翻译,指导RNA诱导沉默复合体(RISC)来调节目的基因表达,介导转录后基因调控。新进的研究表明miRNA不仅调控发育,而且在造血、细胞增殖和死亡等方面发挥作用,另外对心肌肥厚、心力衰竭、动脉粥样硬化和心律失常等心血管系统疾病的发生发展有重要的影响。MiRNA作为转录后调控的重要环节,可以对编码特异离子通道蛋白基因的mRNA表达产生影响,进而使离子通道蛋白及连接蛋白过度表达或低表达,致使离子通道平衡失调,诱发心律失常。miRNA的表达具有组织特异性,如在心肌富含miR-1,let-7,miR-133,miR-126-3p,miR-30c,而动脉平滑肌富含miR-145,let-7,miR-125b,miR-125a,miR-23和miR-143,但miR-1与miR-133在其中也有表达。miR-1与miR-133被认为是肌肉特异性miRNA,在成人的心脏及骨骼肌中优先表达。现在的研究认为miR-1在许多心脏疾病中扮演重要角色,特别是心律失常的病理生理过程。Yang等研究发现:梗死小鼠心脏内过量表达miR-1可以导致心律失常。miR-1通过作用于基因GJA1和KCNJ2减少心肌Cx43,Kir2.1蛋白的表达,使减慢传导,降低了心肌内向整流钾离子电流(IKl),导致细胞膜去极化,促使发生快速性心律失常,心电图中表现为QRS波增宽,QT间期延长。而miR-1通过反义寡核苷酸(AMO-1)被移除后,心律失常的发生明显减少。由此可知miR-1通过引起心肌缺血时离子通道失衡而达到其致心律失常作用。近来在Terentyev等人的研究中发现miR-1还可以通过调节钙离子流来参与心律失常的发生。因此,miR-1被认为是治疗心律失常的新靶点。虽然miR-1在心律失常病理生理过程中的作用已经有所研究,但是miR-1在AF早期ER中所发挥的机制至今还没有报道。目前miRNA-1在体转染的研究中大部分选小鼠为动物模型,转染后将心肌细胞进行体外培养,检测其对应的离子通道蛋白含量的变化,但在大型动物模型中进行miRNA-1在体转染的研究较为少见,而大型动物如犬、兔等AF的发生发展过程更接近于人类,且在体转染miRNA对动物模型AF的维持与诱发等观察更直接,因此,我们选择新西兰大白兔做为AF模型来探讨相关miRNA-1的参与机制,有助于我们更好理解人类AF发生的机制。虽然新西兰大白兔的miRNA序列还没有纳入miRbase数据库中,但我们在Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/Oryctolagus_cuniculus/Info/Index)中找到新西兰大白兔的基因序列草图,可用软件分析出其miR-1的序列。据此,本课题组拟以快速心房起搏兔为研究模型,以miR-1为候选miRNA,活体心房内注射转染miR-1及AMO-1,检测miR-1在快速心房起搏兔模型心房肌中的表达及钾离子通道蛋白含量及其编码mRNA的变化,以阐明miR-1参与AF的发展与维持,为AF的治疗提供新的靶点。研究目的1.评价miR-1在快速起搏1周后在兔心房肌中表达水平的变化;2.明确miR-1的异常表达与快速起搏兔心房早期ER的关系;3.探究miR-1促进心房早期ER的潜在分子机制。材料和方法1.动物模型建立1.1动物分组选购健康新西兰大白兔24只,雌雄不拘,体重1.5-2.5kg,随机分为4组,各组6只。其中第1组设为假手术,第2组设为快速起搏组,第3组设为起搏+miRNA-1转染组,第4组设为起搏+AMO-1转染组。①假手术(第1组,n=6),埋置起搏器不予起搏,1周后开胸,右房(RA)心肌内注射对照病毒,1周后处死;②心房快速起搏组(第2组,n=6),埋置起搏器以起搏频率600bpm连续起搏1周。开胸,RA心肌内注射对照病毒,1周后处死;③心房快速起搏+miR-1转染组(第3组,n=6),埋置起搏器以起搏频率600bpm连续起搏1周。开胸,RA心肌内注射miR-1,1周后处死;④心房快速起搏+miR-1转染组(第4组,n=6),埋置起搏器以起搏频率600bpm连续起搏1周。开胸,RA心肌内注射AMO-1,1周后处死。1.2快速心房起搏模型建立先用3%戊(苯)巴比妥钠(30-35mg/kg)经耳缘静脉将新西兰大白兔麻醉,继以氟烷(2-3%)及一氧化二氮(60-75%)维持麻醉状态(28),仰卧位固定动物,气管插管,呼吸机机械通气,调节呼吸频率30-50bpm,每分通气量15-40ml,吸呼比为2:1。胸颈部用利多卡因局麻并脱毛、常规消毒、铺巾,切开右颈部皮肤、分离皮下组织,暴露右颈内静脉,送入“J”形心房单电极,在X线透视下将电极头端固定于右心耳,整个过程都遵守无菌操作。2.电生理指标检测电生理检查通过多通道程序刺激仪分别于起搏前、转染前、转染1周三个时间点进行,并由电生理记录系统记录下RA心内心电图。AERP的测定采用S1S2反向扫描刺激法,S1S2呈8:1,步长5ms,基础起搏刺激周长分别为150、130ms,AERP定义为S2不引起心房激动的最长S1S2间期。AF由S1S2程序刺激或者burst刺激诱发。3.构建和生产慢病毒新西兰大白兔miR-1和AMO-1的前体序列由TELEBIO公司构建,慢病毒滴度为1×109TU/ml。4.在体基因转染在快速起搏1周后,右胸第4肋间打开胸腔,充分暴露心脏并剥离心包,将慢病毒复合物多点斜行注射到快速心房起搏兔RA前壁,关胸。一周后处死,立即取出心脏用PBS液由主动脉根部逆行灌注,然后分离出RA,拭干后保存在-80。C有待下一步使用。5.实时定量RT-PCR实时荧光定量RT-PCR反应检测miR-1和KCNE1/KCNB2mRNA表达水平。6.Westernblot检测Westernblot检测KCNE1和KCNB2所编码的离子通道蛋白表达水平。7.荧光素梅报告分析通过荧光素梅报告分析证实KCNE1和KCNB2是miR-1的靶基因。结果1.在快速起搏1周后,兔RA可发现早期ER;2.在快速起搏1周后,miR-1的表达水平发生上调;3.通过转染外源基因使miR-1过表达,促进了心房ER的发生,应用AMO-1拮抗miR-1后可逆转上述现象;4.KCNE1和KCNB2是miR-1的靶基因,他们的表达水平呈负相关。结论MiR-1通过作用于其靶基因KCNE1和KCNB2来调节后者编码的钾离子通道蛋白,从而影响心脏钾离子通道及电流,参与了由快速起搏引起的早期心房ER,表明miR-1可能在AF的发生过程中起到重要的作用。因此,miR-1作为治疗AF的潜在靶点具有重要的临床意义。创新性1.用新西兰大白兔制作快速心房起搏动物模型并检测miR-1在心房细胞中的表达变化;2.心房肌内活体注射miR-1及AMO-11周后体外检测离子通道蛋白及其编码基因的变化,探讨miR-1对钾离子通道及心房ER的影响及意义。局限性1.迄今为止,已有数千个microRNA分子先后在生物体内被鉴定,我们只进行了miR-1对心房早期ER的研究。2.同一种miRNA在不同的AF类型或在AF的不同时期发挥作用的不尽相同,我们只研究了miR-1对快速起搏兔右心房早期ER的影响。
【作者】贾晓萌;
【导师】侯应龙;
【作者基本信息】山东大学,内科学,2014,博士
【关键词】微小RNA;房颤;电重构;离子通道;基因转染;

【参考文献】
[1]王旋.商业银行零售岗位能力素质模型研究与应用[D].首都经济贸易大学,工商管理(专业学位),2014,硕士.
[2]吴建涛.浏览器指纹技术研究与实现[D].西北大学,软件工程(专业学位),2014,硕士.
[3]黄娟.基于图像处理技术的医用纱布表面缺陷检测[D].河南科技大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[4]余雪梅.西部地勘员工工作满意度、工作不安全感与离职倾向的关系研究[D].中国地质大学(北京),应用心理学,2013,硕士.
[5]张文泉,张广鹏,李伟,华祥.煤层底板突水危险性的Fisher判别分析模型[J].煤炭学报,2013,10:1831-1836.
[6]黄少华.解毒祛瘀滋阴方及方中主要药物对狼疮性肾炎的干预研究[D].浙江中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[7]田晨.Notch1诱导的小鼠白血病环境对正常造血干祖细胞作用机制的研究[D].北京协和医学院,细胞生物学,2011,博士.
[8]高月霞.社会医疗保险政策对医疗服务影响的效果评价[D].西南财经大学,公共经济学制度与政策,2014,博士.
[9]姜艳丽.我国地方立法后评估问题研究报告[D].黑龙江大学,法律,2012,硕士.
[10]王勇,纪亮,温志斌.网络技术在企业危机管理中的应用[J].经济师,2003,12:113-114.
[11]刘明.审判权的合法化问题探析[D].河北师范大学,政治学理论,2012,硕士.
[12]李娟.北京天坛公园旅游解说效果研究[D].北京林业大学,旅游管理,2013,硕士.
[13]白金勇.新近吹填土地基真空预压法加固新工艺试验研究[D].天津大学,岩土工程,2013,硕士.
[14]陈卓.中老年人高血压病住院患者的中医证型回顾研究[D].北京中医药大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[15]周燕.美国全国教育协会功能探析[D].华东师范大学,教育史,2002,硕士.
[16]郭亚楠.生物分子与TiO_2/石墨烯相互作用的计算机模拟[D].西南交通大学,生物医学工程,2013,硕士.
[17]王凯.《金瓶梅》叙事话语及叙事声音的内涵研究[D].河北师范大学,中国古代文学,2014,硕士.
[18]陈立发.皮下盲袢式胆管空肠Roux-en-Y吻合术治疗复杂肝胆管结石病的临床分析[D].吉林大学,外科学,2013,硕士.
[19]张宇.长春地区EV71的分离鉴定及疏清颗粒的抗病毒药效学研究[D].吉林大学,遗传学,2013,硕士.
[20]杨晓.马克思主义生态观视阈下我国旅游生态环境研究[D].华中师范大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[21]郑晓宇.汽车CAN模块功能测试系统设计及其实时性研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[22]邱俊.基于要素模型的区域GIS的设计与实现[D].浙江大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[23]戴小丽.北宋诗僧的世俗化情怀及文学表达[D].杭州师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[24]任红春.现场指认的立法问题研究[D].大连海事大学,法律,2012,硕士.
[25]王永莉.现代传媒对大学生思想政治教育的作用研究[D].中南民族大学,思想政治教育,2013,硕士.
[26]吕晶晶.基于学生成长需求的本科生导师制研[D].山西财经大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[27]崔卫芳.三江源区庭院生态经济发展模式与效益评价[D].西北农林科技大学,生态学,2013,博士.
[28]金洁,曹利红,韦菊英,刘萍.原发性中枢神经系统淋巴瘤的治疗进展[J].中国肿瘤临床,2014,19:1217-1220.
[29]吴四权.基于Si-H键活化的[PSiP]钳式配体支持的硅基铁钴镍配合物的合成及性质研究[D].山东大学,有机化学,2013,硕士.
[30]罗彦斌,陈建勋,王梦恕.隧道斜交横通道施工对主隧道衬砌结构的影响研究[J].岩石力学与工程学报,2010,S2:3792-3798.
[31]李凌冬.杭长客运专线覆盖型岩溶路基注浆加固效果检测与稳定性分析[D].西南交通大学,地质工程,2014,硕士.
[32]和建政.青海沙蜥低氧习服和适应的不同调节机制及低氧对荒漠沙蜥体温调节和静止代谢率的影响[D].兰州大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[33]胡正平,宋淑芬.基于类别相关近邻子空间的最大似然稀疏表示鲁棒图像识别算法[J].自动化学报,2012,09:1420-1427.
[34]茆勇.当归、阿魏酸钠对脂多糖诱导的急性炎性肝损伤的影响及分子机制[D].苏州大学,病理生理学,2003,硕士.
[35]黄一拯.小鼠足趾来源前体细胞的分离、鉴定及其在再生中的作用[D].华中科技大学,手外科,2013,硕士.
[36]韩调整,黄英,丁娟.双马来酰亚胺/氰酸酯共固化树脂的研究进展[J].中国胶粘剂,2014,11:53-57.
[37]李瑞杰.配送中心布局规划仿真与评价[D].北京交通大学,2010.
[38]罗宁泉.增强学习在共面双机空战格斗中的应用[D].沈阳工业大学,控制理论与控制工程,2003,硕士.
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[40]宋佳.土地征收纠纷解决机制研究[D].中国地质大学(北京),宪法与行政法学,2013,硕士.
[41]宋尚华.山茱萸活性成分提取分离及其治疗糖尿病并发症研究[D].西南大学,药物分析,2013,硕士.
[42]柳维长.组合开关网络的可靠性[J].自动化学报,1965,01:27-32.
[43]宋振国.射频衰减计量保证方案(MAP)[J].宇航计测技术.1990(03)
[44]班守英.广西民族美术资源在普通高校公共美术教学的应用研究[D].广西师范大学,学科教学,2013,硕士.
[45]蒋海霞.中国当代女性文学的女性意识研究[D].广西师范大学,文艺学,2014,硕士.
[46]梁钧泉.大学生微公益活动的思想道德教育功能及其实现研究[D].西南大学,思想政治教育,2013,硕士.
[47]郑旭文.保留与未保留终板的单节段颈前路减压植骨融合术的短期疗效比较[D].河北医科大学,外科学(专业学位),2013,硕士.
[48]李娟娟.石墨烯的成膜、修饰与电容性能的研究[D].南京邮电大学,2011.
[49]陈丽.电容型设备介质损耗因数在线检测技术的研究[D].河北农业大学,农业机械化工程,2004,硕士.
[50]周睿.可调前置导叶对轴流泵性能的影响[D].扬州大学,动力工程,2012,硕士.

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