TSHR基因敲除对小鼠肝脏糖异生影响的研究

【摘要】研究背景：亚临床甲状腺功能减退症(SCH)是指血清促甲状腺激素(TSH)水平升高,但血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)水平正常,患者无明显临床症状的一种甲状腺疾病。随着人们对亚临床甲减的关注和高灵敏度TSH检测技术的应用,亚临床甲减的患病率呈升高趋势。有文献报道称总体人群中亚临床甲减的患病率为4%-10%。近年来有关亚临床甲减的临床研究发现,SCH患者常出现空腹胰岛素水平升高或胰岛素抵抗,服用左旋甲状腺素进行替代治疗使其血清TSH水平降至正常范围后,SCH患者的胰岛素敏感性有所改善,空腹血糖水平有所下降。目前有关此现象的研究较少。有研究结果提示血清甲状腺激素(TH)水平的变化与胰岛素敏感指数呈正相关。然而,有临床研究发现,即使通过相同程度的体育锻炼或减肥后,亚甲减患者胰岛素敏感性的改善程度低于甲状腺功能正常者；正常范围内的血清TSH水平与空腹胰岛素水平呈正相关。此外,有关TSHR基因多态性相关研究发现,TSHR基因Asp727Glu位点的多态性与胰岛素抵抗有关。以上这些临床研究结果提示促甲状腺激素可能在机体糖代谢中发挥作用。TSH是一种由腺垂体合成并分泌的激素,在体内直接参与甲状腺生理功能的调节。TSH与甲状腺细胞膜表面的TSH受体(TSHR)结合后,经G蛋白介导,通过cAMP途径或二磷酸肌醇途径来调节甲状腺滤泡上皮细胞的生长、增殖和分化。TSHR是介导TSH发挥其甲状腺调控功能重要的蛋白分子。TSHR主要表达于甲状腺细胞,但多种甲状腺外组织器官上亦有表达。我们以前的研究证实,肝脏组织表达有功能活性的TSHR,TSH与肝细胞膜上TSHR结合后,上调胆固醇合成的限速酶——3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)表达。肝脏是调节糖脂代谢的重要器官。在空腹状态下,肝脏通过增强糖异生和肝糖原分解来维持空腹血糖的稳定。肝脏是糖异生的主要器官,体内约90%的糖异生在肝脏进行,肝脏糖异生受多种激素的调节,如胰岛素、胰高血糖素和糖皮质激素等。其中胰高血糖素、糖皮质激素对空腹血糖的调节,主要通过cAMP/PKA/CREB信号通路上调糖异生的关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)及葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的表达,从而增强糖异生,增加肝糖输出,升高血糖。可见,cAMP/PKA/CREB信号通路在升糖激素调节空腹血糖水平中扮演重要角色,该信号通路的调节异常对肝脏糖代谢有非常重要的影响。cAMP应答元件结合蛋白(CREB)是细胞核内的重要调控因子,在机体能量物质代谢中有重要作用,其对转录的调节主要是通过其自身磷酸化来实现的。在肝脏糖代谢方面,CREB参与维持空腹血糖的稳定。研究认为,CREB是启动糖异生的关键调控因子,在糖异生关键酶PEPCK和G6P基因的启动子区域,有CREB的结合位点。当CREB与CREB结合蛋白(CBP)结合后,能够促进PEPCK、G6P基因的转录,从而启动糖异生。我们以前的研究发现,TSH可以量效性及时效性的增加L02细胞内cAMP水平,进而激活蛋白激酶A(PKA),增加CREB的磷酸化水平,从而促进肝脏胆固醇合成；提示TSH作为上游分子参与了cAMP/PKA/CREB信号通路的调节,从而影响肝脏脂代谢。由此,我们认为有对TSH是否影响糖代谢进行研究的可能。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是调节能量代谢的重要因子之一,在肝脏的糖代谢中发挥尤为重要的作用。临床常用的降糖药物二甲双胍通过激活肝脏和骨骼肌的AMPK,抑制肝脏糖异生,促进骨骼肌葡萄糖的摄取,增加胰岛素敏感性,发挥降低血糖的作用。AMPK对糖异生的抑制性调节主要通过下调糖异生关键酶的表达来实现。肝脏作为胰岛素作用的三大靶器官之一,在全身性胰岛素抵抗的发生发展中有重要作用。研究证实,AMPK是胰岛素敏感性正向调节因子,AMPK基因敲除可诱导小鼠发生胰岛素抵抗。此外,有研究发现,TSH可以抑制甲状腺细胞的AMPK活性。因此,以上研究进一步在理论上支持我们对TSH在肝脏糖代谢中的影响进行研究。基于以上的研究发现,我们推测TSH可能参与肝脏糖代谢。本研究拟通过体内和体外实验研究TSH对肝脏糖代谢可能存在的影响。研究目的：1.繁殖饲养TSHR基因敲除小鼠,观察TSHR基因敲除对小鼠空腹血糖及胰岛素水平的影响,分析TSHR基因的体内失活对肝糖原含量、肝脏糖异生可能存在的影响。2.在体外实验中观察TSH对肝脏糖异生关键酶表达的影响。研究方法：1.TSHR基因敲除小鼠的繁殖饲养：采用TSHR基因敲除杂合型小鼠交配得到实验所需的野生型小鼠及纯合型小鼠,普通PCR法鉴定小鼠基因型。小鼠的饲养繁殖均在实验动物中心SPF环境中进行。2.小鼠一般发育指标及糖脂代谢相关指标的测定：实验结束时,测量小鼠体长、称量体重、计算脏器指数(肝脏重量/体重、心脏重量/体重、肾脏重量/体重),测定小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、高/低密度脂蛋白水平,测定小鼠血清总T4、TSH、胰岛素、胰高血糖素、胰岛素样生长因子-1及空腹血糖水平,计算胰岛素敏感指数。3.耐量试验：小鼠进行口服葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验及丙酮酸耐量试验,观察TSHR基因敲除对小鼠整体糖代谢水平的影响。4.TSHR基因敲除对小鼠肝脏组织结构及肝糖原分布的影响：小鼠肝脏组织进行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肝细胞的组织学特征；小鼠肝脏组织切片进行糖原染色(PAS染色),观察肝细胞内糖原颗粒的分布情况。5.TSHR基因敲除对小鼠肝糖原含量的影响：采用蒽酮比色法,使用紫外分光光度计测定不同浓度标准葡萄糖溶液的吸光度值,建立标准曲线；提取小鼠肝脏组织糖原,测定吸光度值,参照标准曲线,对小鼠肝糖原含量进行定量。6.TSHR基因敲除对小鼠肝脏糖异生关键酶G6P、PEPCK及葡萄糖激酶(GK)基因表达的影响：采用Real-timePCR法检测TSHR基因敲除小鼠肝脏组织中G6P、PEPCK、GK的基因表达水平,观察TSHR基因敲除对肝脏糖异生能力的影响。7.TSHR基因敲除对小鼠肝脏CREB、AMPK、GSK3β磷酸化蛋白水平的影响：采用WesternBlot法检测肝脏总CREB、AMPK、GSK3β蛋白表达水平及其磷酸化蛋白的表达水平,观察TSHR基因敲除对小鼠肝脏CREB、AMPK、GSK3β蛋白表达水平及其磷酸化水平的影响。8.TSH刺激对HepG2细胞糖异生关键酶表达的影响：0.2μmTSH刺激培养HepG2细胞,测定HepG2细胞糖异生关键酶G6P、PEPCK基因表达水平,在体外观察TSH对肝脏糖异生的影响。结果：1.TSHR基因敲除对小鼠一般发育指标及糖脂代谢相关指标的影响：8周龄TSHR基因敲除小鼠的体重明显低于同周龄野生型小鼠,差异有统计学意义(P<0.01),但各脏器指数(心脏、肝脏、肾脏)均无显著性差异(P>0.05)；TSHR基因敲除小鼠的体长较野生型小鼠偏小,但差异无统计学意义(P>0.05)。TSHR基因敲除小鼠从3周龄断乳时开始饲喂含100ppm甲状腺素的饲料。6周龄及8周龄TSHR基因敲除小鼠的血清总T4水平与同周龄野生型小鼠相比,差异均无统计学意义(P=0.372和P=0.481)。同时,8周龄TSHR基因敲除小鼠的血清TSH水平与同周龄野生型小鼠相比,亦无显著性差异(P>0.05,P=0.759)。与野生型小鼠比较,TSHR基因敲除小鼠的血清总胆固醇及高密度脂蛋白水平均明显降低(P<0.05)；但TSHR基因敲除小鼠的血清低密度脂蛋白水平仅有下降趋势,血清甘油三酯水平有上升趋势,差异均无统计学意义(P>0.05)。8周龄TSHR基因敲除小鼠的空腹血糖水平明显低于同周龄野生型小鼠(P<0.001),胰岛素敏感指数较野生型小鼠增加(P=0.001),差异均有统计学意义；但其空腹胰岛素水平与野生型小鼠相比无显著差异(P>0.05)。同时,TSHR基因敲除小鼠的血清胰高血糖素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平与野生型小鼠相比亦均无显著差异(P>0.05)。2.肝组织HE染色特征：TSHR基因敲除小鼠肝脏组织结构与野生型小鼠相比,无明显变化；光镜下可见排列整齐的肝细胞,呈多边形,中央有大而圆的核,胞质均匀,在汇管区周围呈放射状分布,未见炎性细胞侵润。3.耐量试验：口服葡萄糖耐量试验：两组小鼠分别给予2g/kg葡萄糖灌胃,TSHR基因敲除小鼠各时间点(0min、30min、60min、120min)血糖水平较野生型小鼠各相应时间点血糖水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。胰岛素耐量试验：两组小鼠分别给予腹腔注射1.0U/kg胰岛素,TSHR基因敲除小鼠各时间点(0min、15min、30min、60min、90min)血糖水平较野生型小鼠各相应时间点血糖水平有降低的趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。丙酮酸耐量试验：两组小鼠分别给予腹腔注射2g/kg丙酮酸钠后,TSHR基因敲除小鼠各时间点(30min、60min、90min)血糖水平较野生型小鼠各相应时间点血糖水平降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。4.糖原含量：8周龄TSHR基因敲除小鼠的肝糖原含量明显高于同周龄野生型、鼠,差异有统计学意义(P<0.05,P=0.039),与肝糖原染色观察到的结果一致。5.TSHR基因敲除小鼠肝组织PEPCK、G6P、GKmRNA表达：TSHR、基因敲除小鼠的肝脏组织PEPCK、G6PmRNA表达水平均低于野生型小鼠,分别降低了36%和47%,差异均有统计学意义(P<0.01)；TSHR基因敲除小鼠肝脏GKmRNA表达水平与野生型小鼠相比升高了1.38倍,差异有统计学意义(P<0.05,P=0.025)。6.TSHR基因敲除小鼠肝脏组织AMPK、CREB、GSK3β蛋白表达情况：与野生型小鼠相比,TSHR基因敲除小鼠的肝脏组织总AMPK、CREB、GSK3β蛋白表达水平均没有显著变化(P>0.05),但磷酸化AMPK、GSK3β蛋白表达水平均明显增加,磷酸化CREB蛋白表达水平明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。7.TSH刺激对HepG2细胞PEPCK、G6PmRNA表达的影响：0.2μmTSH刺激HepG2细胞20小时后,HepG2细胞PEPCK、G6PmRNA表达水平与对照组相比均明显增加,分别增加了268%和159%,差异均有统计学意义(P=0.009和P=0.031)。结论：1.TSHR基因敲除可能通过抑制肝脏糖异生降低小鼠空腹血糖水平。2.TSH对肝脏糖异生关键酶的基因表达有直接作用。
【作者】王婷婷；
【导师】赵家军；高聆；
【作者基本信息】山东大学，内科学，2014，博士
【关键词】亚临床甲状腺功能减退；TSH受体；糖异生；PEPCK；G6P；

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