骨桥蛋白不同转录本在乳腺癌发生中的作用及机制研究
【摘要】乳腺癌是影响女性身心健康的常见肿瘤,全球范围内每年有超过13.8万人发病,并有约45.8万患者死于乳腺癌,因此对乳腺癌的防治已成为重大公共卫生议题。目前,由于缺乏完善的筛查标准和治疗靶点,乳腺癌往往在晚期才被诊断,因此,乳腺癌的早期发现是提高疗效的关键。此外,三阴乳腺癌缺乏有效的治疗靶点,而多数ER+乳腺癌患者对辅助激素疗法产生抗性。因此,迫切需要新的治疗靶点以提高乳腺癌的早期诊断并改善传统治疗的疗效。骨桥蛋白(Osteopotin,OPN)是一种多功能的磷酸化糖蛋白分子,在生理病理过程如骨重建、肿瘤发生和炎症中具有重要作用。多种类型肿瘤高表达OPN,体内外实验表明,使用特异性siRNA敲减OPN可显著抑制肿瘤的发生；相反,过表达OPN可以使恶性低的细胞系向恶性转移性转化。机制研究表明OPN主要通过诱导肿瘤细胞增殖和抑制凋亡等途径促进肿瘤的发生,非常有望成为新的肿瘤生物标记分子。相比肿瘤细胞,免疫细胞也表达OPN,是OPN的另一重要来源。免疫细胞来源的OPN具有重要的免疫调节作用,参与调节Th1、Th17免疫应答,在自身免疫疾病中作用显著。另外,免疫细胞来源的OPN可诱导细胞免疫反应,在细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。因此,肿瘤来源的OPN和宿主来源的OPN在宿主免疫和肿瘤发生中具有截然不同功能。此外,巨噬细胞来源的OPN可恢复由于敲除OPN所致的肿瘤细胞迁移的下降,提示不同来源的OPN可相互作用。然而,肿瘤细胞来源的OPN是否能够通过调节免疫细胞的分化和功能进而促进肿瘤的免疫逃逸仍知之甚少。通过选择性剪切,人OPN可形成3种不同转录本形式：OPN-a(全长),OPN-b(缺少外显子5)和OPN-c(缺少外显子4)。目前有关OPN不同转录本的研究主要集中在肿瘤中,OPN转录本在多种类型肿瘤包括肝细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、软组织肉瘤中表达和功能特异。OPN-a和OPN-c诱导人胶质瘤细胞的侵袭,而在前列腺癌中,OPN-b和OPN-c发挥促肿瘤作用。在卵巢癌和乳腺癌中,仅OPN-c促进肿瘤进展。肺癌中,OPN-b影响增殖,而OPN-c则与肿瘤的侵袭相关。临床数据显示OPN-c特异性在乳腺癌中表达,而在正常组织和癌旁不表达。并且与传统的乳腺癌诊断和预后判断分子雌激素受体、孕激素受体和HEE2相比,OPN-c对于乳腺癌的诊断和预后判断更有临床价值。体外功能实验表明OPN-c较其他的转录本更能支持乳腺癌的锚定非依赖性生长。此外,最近的研究发现,OPN的转录本差异调节血管内皮生长因子VEGF的表达及血管生成作用。这些结果均提示OPN不同的转录本可介导不同的功能,可能与其在肿瘤发生和宿主免疫中的功能差异有关。传统的治疗如化疗和放疗可引起“脱靶效应”,而靶向肿瘤组织特异性表达的OPN转录本有望成为特异性更强的治疗方法和策略。然而,OPN不同转录本在体内是否介导不同的功能,是否能够通过调节局部免疫细胞分化和功能进而调节肿瘤发生还知之甚少。本课题在已有研究的基础上,首次通过体内实验深入探讨OPN不同转录本在介导肿瘤发生中的作用及差异。通过液相悬浮芯片技术分析OPN不同转录本调节肿瘤细胞细胞因子表达的表达谱,进一步阐明OPN不同转录本在乳腺癌发生中的作用。此外,本研究从免疫学角度探讨了肿瘤来源的不同OPN转录本对单核细胞分化、NK细胞杀伤功能的影响,以期进一步补充OPN在肿瘤发生及肿瘤免疫逃逸中的作用及机制。第一部分oPN转录本促进乳腺癌体内成瘤目的：构建OPN不同转录本慢病毒表达载体,荷瘤小瘤模型探讨不同OPN转录本对乳腺癌体内成瘤的影响。方法：1.OPN转录本PCR调取以乳腺癌细胞系MDA-MB-435(表达OPN不同转录本)cDNA为模板,利用PCR方法钓取OPN转录本。2.pGC-FU-OPN表达载体构建及验证PCR产物经酶切定向连接至pGC-FU质粒,然后转化大肠杆菌,PCR、测序鉴定阳性克隆,将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提。过表达载体脂质体转染293T细胞,荧光显微镜观察GFP表达、WesternBlot检测OPN以确认融合基因表达。3.OPN转录本慢病毒载体包装将OPN过表达质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,制备慢病毒表达载体,标定病毒滴度。4.慢病毒转染MCF-7将构建好的OPN转录本及对照组慢病毒转染不表达内源OPN的乳腺癌细胞系MCF-7,RT-PCR、WesternBlot、ELISA检测OPN表达是否成功。5.MTT检测细胞增殖体外检测OPN转录本对MCF-7增殖的影响。6.体内成像系统检测OPN转录本对肿瘤生长及转移的影响将转染OPN转录本及对照慢病毒的MCF-7细胞注射小鼠腋下,体内成像系统检测GFP+肿瘤细胞原位生长及肝、肺转移。8周后,处死,分离肿瘤细胞,测量肿瘤体积；肝脏、肺组织,10%甲醛固定,用于病理分析。结果：1.pGC-FU-OPN转录本表达质粒构建成功：PCR结果确认OPN转录本成功调取,菌落PCR选取阳性克隆进行测序,结果显示pGC-FU-OPN转录本成功构建,将构建好的过表达质粒转化293T细胞,荧光显微镜观察GFP表达,WesternBlot检测OPN,确认OPN转录本过表达成功。2.慢病毒包装Real-time结果显示OPN转录本的慢病毒表达载体滴度达到109TU/ml数量级。3.MCF-7成功过表达OPN转录本RT-PCR、WesternBlot表明OPN不同转录本在MCF-7细胞中过表达成功,ELISA检测到肿瘤培养上清中OPN的分泌。4.OPN转录本促进MCF-7增殖MTT结果显示过表达OPN转录本均显著促进MCF-7增殖,转录本之间无显著差异。5.OPN转录本促进体内成瘤所有OPN转录本均显著促进肿瘤体内生长,但转录本之间并没有显著差异。此外,模型中并未检测到肿瘤的肝脏、肺脏转移。结论：OPN转录本慢病毒表达载体成功构建,体内外实验均表明OPN促进乳腺癌细胞生长,但OPN转录本之间并无显著差异。第二部分肿瘤来源oPN转录本诱导单核细胞选择性活化目的：探讨肿瘤来源OPN转录本对单核细胞活化的调节作用及机制,补充OPN促进肿瘤免疫逃逸的分子机制。方法：1.肿瘤上清制备：无血清1640培养转染OPN转录本及pGC慢病毒的MCF-7(1×105/ml)24h,10000g离心5min,收集上清。机制实验中用阻断抗体或重组细胞因子处理肿瘤上清。2.单核细胞分选：密度低度离心分离健康献血员外周血单个核细胞,CD14磁珠阳性分选单核细胞,流式细胞术检测细胞纯度。3.肿瘤上清与单核细胞共培养：调整单核细胞浓度为2×105/ml,与肿瘤上清共培养40h,收集细胞,一部分用于表型分析；另一部分单核细胞加PBS洗细胞,然后100ng/mlLPS刺激6h,收取上清,用于检测细胞因子。4.流式细胞术：用于分析MCF-7表面CD44、αVβ3的水平；检测共培养单核细胞表面HLA-DRCD206、CD163的水平。5.悬浮芯片：检测过表达OPN转录本或者rhOPN刺激的肿瘤上清中细胞因子的水平。6.ELISA：检测rhOPN刺激的肿瘤上清中MCP-1、TGF-β1的水平；检测共培养单核细胞细胞因子的表达。结果：1.OPN转录本差异调节CD163与转染OPN-a和OPN-b相比,过表达OPN-c显著上调单核细胞CD163。但过表达OPN转录本的肿瘤上清对HLA-DR和CD206没有显著作用。2.OPN转录本调节单核细胞TNF-α、IL-10的表达过表达OPN转录本的上清均显著抑制单核细胞TNF-α,促进IL-10的水平。3.OPN通过CD44通路调节肿瘤细胞TGF-β1和MCP-1表达过表达OPN转录本显著诱导肿瘤细胞TGF-β1和MCP-1的表达,但不影响IL-6、IL-8和MCP-1的水平;rhOPN确认其对TGF-p1和MCP-1的调节作用；MCF-7表达CD44,不表达αVp3,阻断CD44通路抑制OPN对TGF-p1和MCP-1的诱导作用。4.OPN通过TGF-β1和MCP-1调节单核细胞细胞因子表达通过使用阻断抗体和重组细胞因子,我们证明肿瘤来源OPN分别通过MCP-1和TGF-β1调节单核细胞TNF-α和IL-10结论：OPN通过CD44调节肿瘤细胞MCP-1和TGF-β1的表达,进而诱导单核细胞选择性活化,可能是肿瘤免疫逃逸的另一重要机制。第三部分OPN通过NKG2D-MICA促进肿瘤逃避NK杀伤目的：探讨OPN对NKG2D-MICA通路及NK细胞杀伤的调节作用,进一步揭示OPN在肿瘤免疫逃逸中的作用机制。方法：1.MCF-7与NK92共培养rhOPN刺激MCF-7细胞,然后与NK92细胞按照1：1的比例共培养不同时间,流式细胞术检测杀伤。2.杀伤检测共培养细胞,标记CD56和AnnexinV抗体,流式细胞术分析CF56-肿瘤细胞AnnexinV阳性率,评价杀伤。3.RT-PCRRT-PCR方法检测MICA、MMP-14和ADAM-17的水平。4.细胞表面MICA水平检测流式细胞术检测肿瘤细胞表面MICA的水平。5.sMICA检测MCF-7细胞用rhOPN,ELISA检测上清中sMICA水平。结果：1.OPN促进肿瘤抵抗NK杀伤NK92细胞表达CD56,MCF-7细胞不表达CD56,通过使用CD56区分共培养体系中的两种细胞。经OPN刺激的MCF-7与NK92共培养后CD56-肿瘤细胞AnnexinV阳性率显著低于未经OPN刺激组。2.OPN促进MICA剪切rhOPN并不影响MICAmRNA的表达,显著下调MCF-7表面MICA的水平,并可显著增加肿瘤上清中sMICA的水平。3.OPN通过ADAM-17促进MICA剪切OPN可显著诱导ADAM17的表达,不影响MMP-14的水平；特异性阻断ADAM17可抑制MICA的剪切,并且部分恢复NK92对MCF-7的杀伤。结论：我们的研究表明OPN可促进MICA的剪切,破坏NGG2D-MICA之间的相互作用,进而促使肿瘤抵抗NK的杀伤作用,丰富了OPN在肿瘤发生中的作用机制,为基于OPN和基于N的抗肿瘤免疫治疗提供新的思路。
【作者】孙锦堂；
【导师】曲迅；
【作者基本信息】山东大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】乳腺癌；骨桥蛋白；转录本；慢病毒载体；单核细胞活化；免疫逃逸；MICA；NKG2D；
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