酯酶、脂肪酶的筛选、表达和性质表征

【摘要】酯酶（Esterase）是一类能够催化酯键形成和断开的水解酶，普遍存在于动物、植物和微生物中，能够参与酯化、转酯及对光活性物质进行动力学拆分等多种反应。微生物酯酶是一类十分重要的工业酶类，其催化反应时不需要辅酶，且具有反应条件温和、方法简单、催化活性高、选择性强、产物易于分离回收等优点，所以酯酶被广泛应用在食品工业、医药工业、化工业、环保和生物防护等领域。由于嗜热酯酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使其广泛应用于食品、医药、制革、石油开采及废物处理等方面。工业用的酯酶多数来源于微生物。传统获得酯酶的方法主要是从土壤中进行多轮筛选，获得产酯酶的菌株，再进行培养优化等，以获得理想菌株。这种方法有一定的局限性，往往产酶量不高，或者达不到工业化的规模。现在多采用基因工程的手段，构建重组质粒，选择合适的表达宿主来获得较高的表达量。本文从AlcanivoraxborkumensisSK2（食烷菌，泊库岛食烷菌）、ThermomonosporacurvataDSM43183（弯曲高温单孢菌）及ThermotoganaphthophilaRUK-10（一种栖热袍菌）三种细菌出发，根据NCBI数据库，从它们的基因组序列中筛选出疑似编码Esterase/Lipase的基因序列，并以此为模板使用Primer5.0软件设计出相应的引物，经PCR获得目的片段；以相应质粒作为载体构建重组质粒；在大肠杆菌中进行表达，选择相应底物测定酶活，并判定是否为Esterase/Lipase。若为Esterase/Lipase，经蛋白纯化后，对其理化性质进行表征，并测定其动力学常数，为以后的相关催化实验打好基础。本文成功筛选并表达出了酯酶ABO-2454、ABO-2108（来自AlcanivoraxborkumensisSK2）和嗜热酯酶Tnap-0664和Tnap-1739（来自ThermotoganaphthophilaRUK-10），经过蛋白纯化和酯酶活性测定，最终获得嗜热酯酶Tnap-0664。根据实验结果分析，天然状态下Tnap-0664以四聚体形式存在（单体分子量为43.8kDa），经热处理和阴离子交换层析纯化后，最后的纯化倍数为8.43倍，蛋白回收率为41.97%；Tnap-0664偏好短碳链底物，碳链越长，水解能力越弱；最适温度为≥100℃；最适pH为9.0；Tnap-0664在70、80、90℃下的半衰期分别为150h、120h、20h，由此得出，Tnap-0664有较好的热稳定性；在pH8-10时，仍可保留80%以上的酶活，具有较好的pH稳定性；金属离子稳定性方面，在K+、Na+存在时，Tnap-0664的酶活力为111.73%和115.77%，说明K+、Na+能轻微促进酶活，在Ni2+、Mg2+存在时，Tnap-0664的残余活力为73.85%和69.46%，说明Ni2+、Mg2+能轻微抑制酶活，当Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+存在时，酶活被强烈抑制，Tnap-0664的残余活力分别为19%、2.08%、2.44%、3.04%和0%，有EDTA存在时，剩余活力为112%，说明Tnap-0664不是金属离子依赖性的酶。有机溶剂存在时，除乙酸强烈抑制酶活外，实验中涉及的其他溶剂均轻微抑制酶活，说明Tnap-0664有较好的有机溶剂耐受性。Tnap-0664的Km为76.5μM，Kcat为182，500S-1。
【作者】王叶青；
【导师】高仁钧；解桂秋；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】Esterase/Lipase；克隆；表达；纯化；表征；

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