去肾动脉神经对SHR肾交感神经活性及钠处理的影响

【摘要】交感神经系统的过度激活在高血压的产生和维持中起重要作用。去肾动脉神经可降低外周及中枢交感活性，促进肾钠排泄，降低血压。肾交感神经的血压调控机制至今尚未明确阐明。去肾动脉神经通过什么途径和机制降低外周及中枢交感神经活性，调节钠处理，目前国内外报道未完全阐明。肾脏交感神经通过刺激肾小管上皮细胞α1B受体激活多种细胞信号途径，增强肾小管钠氢交换蛋白（NHE）与Na+-K+-ATP酶活性，肾小管钠重吸收增加；同时RAAS激活，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作用于近曲肾小管上皮细胞，同时刺激醛固酮（ALD）的释放使肾小管钠重吸收增加；此外，内源性哇巴因（EO），可增加交感神经活性，激活肾脏Na＋-K＋-ATP酶α1亚基及增加NHE表达，最终导致血压升高。本研究的目的是首先观察去肾动脉神经对SHR肾脏交感神经活性和钠处理的影响，进而通过观察其对RAAS和EO含量的影响，肾脏NHE表达和Na＋-K＋-ATP酶活性及表达的调节，探讨去肾动脉神经对肾脏钠处理的调节机制，探讨肾交感神经在高血压发生发展和维持中的机制。本研究拟采用溶于苯酚乙醇溶液涂抹SHR肾动脉周围进行去肾动脉神经，进行一下四方面研究。第一部分去肾动脉神经的SHR模型建立及肾交感神经活性检测目的：通过苯酚消蚀法去肾动脉神经构建SHR模型，通过检测血清和肾组织NE含量，以及肾组织酪氨酸羟化酶（TH）染色证实该模型对肾交感神经活性的影响；同时检测下丘脑和肾上腺交感活性，以了解该模型下丘脑和肾上腺交感活动的改变。方法：取16只12周龄的雄性SHR随机分为二组，并取8只相同周龄的雄性对照WKY大鼠，分为去肾神经组（RDNX）、假手术组（Sham）和正常对照组（WKY）。采用tail-cuff法测定血压参数和心率。于术后2周，经腹主动脉采血，分别取肾脏、下丘脑、肾上腺。采用高效液相色谱法（HPLC）检测血清及组织NE含量。采用免疫组织化学方法检测肾脏、下丘脑和肾上腺组织TH蛋白染色。结果：1．RDNX大鼠收缩压（SBP）、舒张压（DBP）及平均动脉压（MBP）均显著低于Sham组（P<0.05）。2．RDNX组血清NE含量与Sham组相比显著降低（14.02±2.37vs.23.04±8.77ng/ml，P＜0.05），在肾（0.91±0.21vs.1.34±0.18ng/mg）、下丘脑（1.52±0.43vs.2.95±0.67ng/mg）及肾上腺组织（271.80±50.10vs.371.48±76.62ng/mg）NE含量亦显著降低（P均＜0.05）。3．相关性分析显示MBP与血清NE水平呈显著正相关（β=0.784，r2=0.615，P＜0.001）。4．RDNX组TH蛋白在肾小叶间动脉表达与Sham组相比显著降低（0.13±0.04vs.0.08±0.02，P＜0.05）；肾上腺髓质细胞TH蛋白免疫组化染色阳性细胞百分比显著减少（21.31±2.52vs.47.56±5.17%，P＜0.05）；下丘脑视旁核细胞TH蛋白阳性表达百分比与Sham组相比显著降低（16.22±2.51vs.30.35±4.33%，P＜0.05）。结论：采用苯酚消蚀法成功构建的去肾动脉神经SHR模型血清和肾组织NE水平降低，肾小叶间动脉TH蛋白表达减少，血压降低；同时下丘脑及肾上腺交感神经活性降低。第二部分去肾动脉神经对SHR肾钠处理的影响目的：通过观察去肾动脉神经术后SHR肾脏钠排泄、肾小管重吸收功能的变化，以及肾小球硬化指数、肾小血管厚度和肾间质纤维化的改变，探讨交感神经活性对钠处理、肾功能和肾血管的影响。方法：12周龄的雄性SHR和WKY大鼠，分为RDNX、Sham和WKY组。于处死前收集24h尿液；于术后2周，经腹主动脉采血，取肾脏组织。采用自动生化分析仪检测各组大鼠血钠、钾、肌酐和总蛋白水平，以及尿钠、钾、尿肌酐、尿蛋白水平。原子吸收光度计检测血、尿锂离子浓度。计算内生肌酐清除率（Ccr）、钠清除率（CNa）、锂排泄分数（FELi）、远端肾小管钠重吸收率（FDRNa）和尿肌酐与血肌酐比值（Ucr/Scr）。肾组织石蜡切片PAS染色和Masson染色，计算肾小球硬化指数（GS）、肾间质纤维化指数（IF）及肾小叶间动脉血管壁中层厚度与内径比值。结果：1．RDNX组、Sham组与WKY组间肾重指数、Ccr及24h尿蛋白的比较均差异无统计学意义（P均＞0.05）。2．RDNX组与Sham组相比CNa和FELi均升高（P＞0.05），FDRNa组间差异无统计学意义。3．RDNX组与Sham组相比Ucr/Scr升高（79.87±26.92vs.135.74±37.21，P=0.003）。4．RDNX组与Sham组相比GS指数降低（0.53±0.09vs.0.21±0.05，P＜0.05）。5．RDNX组与Sham组相比肾小叶间动脉血管壁中层厚度与内径比值降低（0.54±0.07vs.0.28±0.04，P＜0.05）。6．RDNX组、Sham组与WKY组间IF值差异无统计学意义（P=0.34）结论：去肾动脉神经可以降低SHR近端肾小管钠的重吸收，肾钠排泄增加，改善肾小管浓缩稀释功能及肾小球滤过功能，同时延缓肾小球硬化的发展和改善肾血管阻力。第三部分去肾动脉神经对SHRRAAS的影响目的：通过观察去肾动脉神经对SHRRAAS的影响，探讨去肾动脉神经对肾钠处理的调节机制。方法：12周龄的雄性SHR和WKY大鼠，分为RDNX、Sham和WKY组。于术后2周采血，分别取肾脏、下丘脑、和肾上腺。采用放免法检测血清及组织醛固酮（ALD）水平。采用荧光定量PCR检测肾脏血管紧张素受体1型（AT1R）mRNA表达。免疫组化染色检测肾脏组织切片AngⅡ和AT1R蛋白的表达。结果：1．去肾动脉神经术后SHR血清、肾脏、肾上腺及下丘脑组织ALD水平均降低（P均＜0.05）。2．RDNX组肾脏AT1RmRNA表达较Sham组降低（P＜0.05），Fold为﹣2.22。3．RDNX组肾皮质和肾外髓部外带（OSOM）AT1R蛋白表达较Sham组降低（P＜0.05），而在各组大鼠肾外髓部内带（ISOM）的表达差异无统计学意义。4．RDNX组肾皮质、OSOM和ISOMAngⅡ蛋白的表达均较Sham组显著降低（P＜0.05）。结论：去肾动脉神经可以降低SHR血清、肾脏、肾上腺及下丘脑组织ALD水平，降低肾组织AngⅡ和AT1R的表达，从而在钠处理中发挥作用。第四部分去肾动脉神经对SHR肾内源性哇巴因的影响目的：通过观察去肾动脉神经对SHR肾组织EO含量和Na+-K+-ATP酶活性和表达的影响，探讨去肾动脉神经对肾钠处理的调节机制。方法：12周龄的雄性SHR和WKY大鼠，分为RDNX、Sham和WKY组。于术后2周采血，分别取肾脏、下丘脑、和肾上腺。采用放免法检测血清及组织EO含量。采用酶学比色法测定肾组织Na+-K+-ATP酶活性。采用荧光定量PCR检测肾脏Na+-K+-ATP酶α1和β1亚基mRNA表达。免疫组化染色检测肾脏组织切片Na+-K+-ATP酶蛋白的表达。结果：1．去肾动脉神经术后SHR血清、肾脏及下丘脑组织EO含量均降低（P均＜0.05），而肾上腺EO含量无改变。2．Sham组肾组织Na+-K+-ATP酶活性与WKY组相比显著升高（P=0.02）。去肾动脉神经术后，可使升高的肾组织Na+-K+-ATP酶活性显著降低。同时，相关性分析显示肾组织NE含量与Na+-K+-ATP酶活性呈显著正相关（r2=0.579，β=0.733，P＜0.05）。3．RDNX组肾脏Na+-K+-ATP酶α1mRNA表达较Sham组降低（P＜0.05），Fold为﹣1.92。RDNX、Sham与WKY组间Na+-K+-ATP酶β1mRNA表达差异无统计学意义（P=0.63）。4．RDNX组肾皮质、OSOM和ISOM的Na+-K+-ATP酶蛋白表达（分别为0.0956±0.0144，0.1310±0.0175，0.1693±0.0136）均较Sham组降低（P＜0.05）。结论：去肾动脉神经可以SHR降低血清、肾脏及下丘脑组织EO含量，进而降低肾脏Na＋-K＋-ATP酶活性及Na+-K+-ATP酶α1的表达，从而在降低肾小管钠的重吸收；此外肾上腺EO的合成和分泌可能存在自身反馈调节作用。第五部分去肾动脉神经对SHR肾脏钠氢交换蛋白表达的影响目的：观察去肾动脉神经对肾脏NHE1、NHE3及其调节因子NHERF1和NHERF2表达的影响，进一步探讨肾脏交感神经在肾脏钠处理调节中的作用。方法：12周龄的雄性SHR和WKY大鼠，分为RDNX、Sham和WKY组。采用荧光定量PCR检测肾脏NHE1、NHE3、NHERF1和NHERF2mRNA表达。采用Western-blot和免疫荧光染色检测肾脏NHE1、NHE3、NHERF1和NHERF2蛋白表达。结果：1．RDNX组与Sham组相比肾脏NHE1mRNA表达降低（P＜0.05），Fold为﹣1.84；NHE3mRNA表达降低，Fold为﹣4.02；NHERF1mRNA表达显著升高，Fold为2.09；NHERF2mRNA表达降低，Fold为﹣2.95。2．Western-blot检测结果显示，RDNX组与Sham组相比NHE1、NHE3和NHERF2蛋白表达均降低（P＜0.05），NHERF1蛋白表达增加（P＜0.05）。3．免疫荧光检测结果显示，RDNX组与Sham组相比NHE1、NHE3和NHERF2蛋白表达降低（P＜0.05），NHERF1蛋白表达升高（P＜0.05）。结论：去肾动脉神经可降低SHR肾组织NHE1及NHE3的表达；同时NHERF1表达升高，而NHERF2表达降低。总而言之，本课题研究结果显示:（1）采用苯酚消蚀法构建的去肾动脉神经SHR模型，血清及肾组织交感神经活性降低，血压下降；同时下丘脑和肾上腺组织交感神经活性降低。（2）去肾动脉神经降低SHR近端肾小管钠重吸收，肾钠排泄增加，改善肾小管浓缩与稀释功能，并延缓高血压肾小球硬化的发展和改善肾血管阻力。（3）去肾动脉神经可降低SHR血清、肾及下丘脑组织ALD水平，肾组织AngⅡ及AT1R的表达。（4）去肾动脉神经可降低SHR血清、肾及下丘脑组织EO含量，使肾组织Na＋-K＋-ATP酶活性及Na+-K+-ATP酶α1表达降低，从而减少肾小管钠重吸收。（5）去肾动脉神经可降低SHR肾组织NHE1和NHE3表达，进而肾脏钠排泄增加。
【作者】李健玲；
【导师】伍伟锋；
【作者基本信息】广西医科大学，心血管内科，2014，博士
【关键词】去肾动脉神经；交感神经活性；肾钠处理；内源性哇巴因；钠氢交换蛋白；

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