松褐天牛OBPs基因克隆与分析

【摘要】松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(SteinerandBuhrer)Nickle(Nematoda:Aphelenchoididae)是松树重要的病原,导致松树死亡,造成严重的生态及经济损失。松褐天牛MonochamusalternatusHope是松材线虫病在中国的主要传播媒介,控制松褐天牛是防治松材线虫病的主要手段。松褐天牛属蛀干性害虫,幼虫生活隐蔽,传统的防治方法难以奏效,目前利用引诱剂进行防治也有进展,但也存在一定问题。为此,如果能够明确其嗅觉感受的机制将对治理该害虫具有重要的借鉴意义。昆虫嗅觉在其寄主定位、寻找配偶中起着重要的作用,目前普遍认为气味结合蛋白OdorantBindingproteins(OBPs)在结合气味分子并转运到气味受体起到重要作用,但对于其具体的功能还不清晰。为此,本研究以松褐天牛为研究对象,在构建其触角cDNA文库的基础上,克隆其OBPs基因,并在原核表达的基础上,测定OBPs与气味物质的结合特性,以期为结合气味分子提供理论基础。主要结果如下：1松褐天牛触角cDNA文库的构建成功构建松褐天牛触角cDNA文库,挑取2052个单克隆进行测序,经过去冗余拼接的到1133条Unigenes,其中多拷贝contigs有276个,单拷贝singlets有857个。通过预测开放阅读框,计算得到松褐天牛触角cDNA文库GC含量为41.8%。通过与COG功能比对350条Unigenes被分到了21个功能类群。通过BLASTx比对从松褐天牛触角cDNA文库发现了4个OBPs基因和一个化学感受蛋白ChemosensoryProtein(CSP)基因,为研究松褐天牛分子生物学奠定基础。2松褐天牛OBPs的克隆及序列分析通过PCR技术克隆得到了4个OBPs基因的全长,MaltOBP2.MaltOBP3.MaltOBP4和MaltOBP5(GenBank登录号分别为：KF460431、KF460432.KF460433和KF460434)开放阅读框分别为402、408、423和378bp,编码133、135、142和125个氨基酸,信号肽预测表明4个蛋白分别有16、20、19和18个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明MaltOBP2和MaltOBP5属于Minus-COBP,MaltOBP3和MaltOBP4属于ClassicOBP。同源比对表明这4个蛋白相互之间的同源性相似比较低,而在进化树中MaltOBP2和MaltOBP5处于Minus-COBP的亚支,MaltOBP3和MaltOBP4位于ClassicOBP亚支,但是4个OBPs都处于不同的分支上,以上表明4个OBPs属于不同的亚族,可能它们在松褐天牛具有不同的功能。3松褐天牛OBPs的原核表达、蛋白纯化及荧光结合特性分析成功构建松褐天牛OBPs基因原核表达载体pGEX-6p-1-MaltOBPx,4个OBPs基因都能在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达,但是在常温时均表达在包涵体中不利于蛋白纯化,改变诱导条件成功使pGEX-6p-1-MaltOBP3和pGEX-6p-1-MaltOBP5在上清中表达,通过GST亲和层析柱纯化获得纯度较高的融合蛋白,利用Precissionprotease切除标签获得获得纯化的目的蛋白。通过竞争结合实验以1-NPN为探针研究MaltOBP3和MaltOBP5与17种挥发物的结合能力。结果表明,MaltOBPs表现出不同的结合特性,MaltOBP3和MaltOBP5与(+)-柠檬烯氧化物、(-)-柠檬烯、对丙基甲苯、(R)-a-蒎烯、(+)-p-蒎烯均具有较强的结合能力,而MaltOBP3与异松油烯、α-异松油烯、(-)-异长叶烯结、p-石竹烯、崁酮、丁羟基甲苯结合较强,MaltOBP5与R-(-)-柠檬烯、(+)-a-蒎烯结合力较强。
【作者】高雄；
【导师】王满囷；
【作者基本信息】华中农业大学，农业昆虫与害虫防治，2014，硕士
【关键词】松褐天牛；气味结合蛋白；cDNA文库；原核表达；荧光竞争结合试验；

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