高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体的筛选和相关基因与致病力的关系研究

【摘要】烟曲霉（Aspergillusfumigatus）是自然环境中广泛存在的腐生真菌，分生孢子体积较小（直径为2～3μm），可以经空气播散且存活时间较长。人体每天吸入几百个烟曲霉分生孢子，这些孢子可以经鼻腔、气管到达支气管末端和肺泡。机体免疫功能健全的情况下，非特异性和特异性免疫应答可以有效清除这些孢子。然而，近些年随着临床上骨髓移植、器官移植以及化学药物治疗的开展，白血病、囊泡性纤维化、感染HIV等患者的增加，类固醇类激素、糖皮质激素和免疫抑制剂的使用导致机体免疫功能受损，防御能力降低，无法抵御烟曲霉分生孢子的黏附和侵袭，致使烟曲霉引起的感染病死率一直在50%以上。1、利用根癌农杆菌介导的遗传转化体系获得烟曲霉T-DNA插入突变体根癌农杆菌携带有一个肿瘤诱导质粒（tumor-inducingplamid，Ti质粒）。根癌农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒的基因片段即T-DNA（transferDNA）能够随机整合到宿主染色体，导致细胞生长调控失衡，形成冠瘿瘤。质粒上的毒力基因在侵染过程中编码毒力蛋白，负责单链T-DNA的形成、转移和随机插入基因组。利用根癌农杆菌介导的遗传转化体系（Agrobacteriumtumefaciens-mediatedT-DNAinsertionalmutagenesis，ATMT）获得3205株烟曲霉T-DNA插入突变体（Aspergillusfumigatusinsertionmutants，AFM），每一个突变体都相当于一个基因敲除株，T-DNA插入突变缺失位点多为单拷贝，HI-TAILPCR和BLAST方法可以定位插入位点相关基因，从而为研究基因功能提供菌株资源。2、筛选高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体利用由无机盐离子NaCl构成高渗透压力，平板法筛选在1.25MNaCl浓度下较野生型菌落直径减小、分生孢子生成障碍等表型发生改变的T-DNA插入突变体，总共从2086株中筛选出320株，建立高渗敏感烟曲霉T-DNA插入突变体亚库。其中108株突变体通过HI-TAIL-PCR和BLAST确定插入突变基因，分析结果这些基因渗透压感受、膜通道、能量代谢和细胞周期等相关。3、构建烟曲霉金属平衡蛋白bsd2基因敲除株和回复突变株AFM3217在1.25MNaCl浓度下表现为菌落直径减小、白化，分生孢子生成减少。HI-TAIL-PCR和BLAST比对确定打断的序列位于bsd2基因上游启动子区域的TATA盒，阻碍了转录因子与启动子区域的结合，导致bsd2基因不能表达。bsd2基因敲除株与AFM3217表型基本一致，回复突变株与野生型表型基本一致。4、致病力和药物敏感性实验烟曲霉秀丽隐杆线虫感染模型显示与野生型相比，AFM3217的致病力明显下降。采用美国国家临床试验室标准化委员会（CLSI，原NCCLs）颁布的微量稀释法方案（M38-A2），结果显示AFM3217对氟康唑（fluconazole，FCZ）、伊曲康唑（itraconazole，ITC）、伏立康唑（voriconazole，VCZ）、泊沙康唑（posaconazole，POS）、两性霉素B（amphotericinB，AMB）、卡泊芬净（caspofungin，CAS）、特比萘芬（terbinafine，TRB）和匹马毒素（pimagedine，PIM）的敏感性与野生型无明显差异。
【作者】吕惠影；
【导师】王丽；
【作者基本信息】吉林大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】烟曲霉；高渗胁迫；T-DNA；致病力；

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