沉默ZFX对人骨肉瘤细胞侵袭及迁移能力的影响

【摘要】目的明确骨肉瘤细胞及组织中ZFX基因的高表达与肿瘤发生的相关性，构建ZFX基因siRNA慢病毒载体，并转染骨肉瘤Saos-2、MG-63细胞，观察转染后骨肉瘤细胞的ZFX的表达水平。通过下调ZFX基因在骨肉瘤Saos2、MG-63细胞中的表达，观察其对骨肉瘤Saos2、MG-63细胞侵袭及迁移能力的影响。阐明其在骨肉瘤中的功能作用。方法选取四种骨肉瘤细胞株U2-OS，Saos-2，MG-63和SW1353，及选取47例手术时病理检查证实为骨肉瘤的组织标本，人脑胶质瘤U251细胞作为ZFX表达的阳性对照，通过Westernblot检测四种骨肉瘤细胞及47例骨肉瘤组织标本中的ZFX的表达水平。并分析ZFX表达与骨肉瘤发生的相关性。根据文献报道的ZFX基因shRNA序列进行合成，并构建ZFX-siRNA慢病毒载体，经DNA测序确认构建成功后转染骨肉瘤Saos2、MG-63细胞。采用Realtime-PCR检测病毒转染后Saos-2及MG-63的ZFX表达水平。最后采用Transwell实验分别观察转染siRNA-ZFX慢病毒载体的Saos2、MG-63细胞（Lv-shZFX）、空白对照(Con)、转染含无义序列的慢病毒载体(Lv-shCon)三组细胞的侵袭及迁移能力变化，其中转染含无义序列的慢病毒载体(Lv-shCon)为阴性对照。细胞计数使用25μL流式细胞仪分析。运动实验使用Transwell细胞运动试剂盒。结果ZFX在四种骨肉瘤细胞系均有表达。与U2OS细胞株相比，三种细胞系（MG63，Saos2和SW1353）表达了高水平的ZFX。ZFX在51.1%（24/47）的骨肉瘤患者组织标本中高表达。而且，骨肉瘤组织中ZFX的高表达与转移显著相关（P<0.05）。经DNA测序鉴定确认慢病毒载体构建成功后，分别转染骨肉瘤细胞株Saos-2及MG-63，质粒携带有GFP绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜下，转染成功的细胞可见绿色荧光。镜下观察可见GFP表达在超过90％的细胞中可被观察到，证明细胞转染成功。通过Real-timePCR验证ZFX基因沉默效率。结果显示，siRNA-ZFX（Lv-shZFX）组细胞中ZFX基因在mRNA水平较CON及Lv-shCon组明显下降(P<0.05)。而CON与Lv-shCon两组间差异无统计学意义(P>0.05)。证实了shRNA慢病毒对ZFX基因具有显著的沉默效率。Transwell侵袭试验结果显示siRNA-ZFX(Lv-shZFX)组较CON及Lv-shCon组的侵袭率显著减低（P<0.05)。而CON与Lv-shCon两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论在骨肉瘤中，特异性高表达的ZFX可能与骨肉瘤的转移相关。ZFX基因的沉默使骨肉瘤Saos2、MG-63细胞的侵袭迁移能力明显下降，ZFX可能为RNAi有效治疗骨肉瘤患者提供一个理想的靶点。
【作者】熊佳时；
【导师】沈赞；
【作者基本信息】苏州大学，肿瘤学，2014，硕士
【关键词】骨肉瘤；ZFX；侵袭及迁移；shRNA；

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