慢病毒载体介导的整合素β1基因沉默对体外难治性癫痫细胞神经网络形成的作用及分子机制研究

慢病毒载体介导的整合素β1基因沉默对体外难治性癫痫细胞神经网络形成的作用及分子机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-16 分类:期刊论文 喜欢:2130
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【摘要】第一部分Real-timeqPCR检测大鼠Sombati难治性癫痫细胞模型中Integrinβ1基因表达变化目的:整合素-跨膜系统主要介导细胞与细胞外基质的相互作用,本实验初步探讨在海马神经元的体外癫痫细胞模型中的细胞表面受体整合素β1(Integrinβ1)在癫痫致痫性形成中的可能作用。方法:利用NeurobasalMedium无血清神经培养基和B-27因子体外培养SD新生乳鼠的海马神经元,对培养至第14天的细胞,参照Sombati的方法制备体外难治性癫痫模型,随机分为正常对照组(Control)、Sombati癫痫细胞模型组(低Mg2+),分别在用含有1mMMg2+的pBRS液或低Mg2+的pBRS液培养细胞3h后,各组神经元在恢复维持培养基继续培养,在之后的第4天,采用Real-timeqPCR方法检测Integrinβ1的表达。结果:Sombati癫痫细胞造模后4天与正常海马神经细胞相比,Integrinβ1基因表达水平均明显高于正常海马神经细胞。结论:Integrinβ1基因在Sombati癫痫细胞模型中表达增高,可能参与了难治性癫痫的形成过程。第二部分Integrinβ1shRNA重组慢病毒载体的构建及其对Sombati难治性癫痫细胞Integrinβ1基因表达的影响目的:构建Integrinβ1基因RNA干扰慢病毒载体,为研究Sombati癫痫细胞模型Integrinβ1的作用机制提供载体。方法:(1)针对Integrinβ1目的基因序列,利用的RNA干扰序列设计软件,设计4个针对Integrinβ1的RNA干扰靶点序列,构建4个shRNA慢病毒重组质粒,测序鉴定阳性克隆,常规培养HEK293T细胞,将慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进HEK293T细胞进行慢病毒包装、浓缩、滴度测定,并收集病毒。(2)常规培养PC12细胞,将构建的Integrinβ1shRNA1-4转染PC12细胞,分为Integrinβ1shRNANC组、Integrinβ1shRNA1组、Integrinβ1shRNA2组、Integrinβ1shRNA3组和IntegrinshRNA4组,在倒置荧光显微镜下观察,估算慢病毒感染PC12细胞的效率,并采用Westernblotting检测Integrinβ1shRNA系统在PC12靶细胞中的沉默效果,以筛选出沉默效果最好的其中一条Integrinβ1shRNA慢病毒载体。(3)常规培养至第11天的海马神经元,分别转染Integrinβ1shRNANC和筛选出来的沉默效果最好的Integrinβ1shRNA2慢病毒,继续培养至第14天,参照Sombati方法制备体外难治性癫痫模型的方法,将已经转染Integrinβ1shRNANC的细胞,用低Mg2+的pBRS液或者含有1mMMg2+的pBRS液分别培养细胞3h,同时将已经转染Integrinβ1shRNA2慢病毒的细胞,用低Mg2+的pBRS液或者含有1mMMg2+的pBRS液分别培养细胞3h,具体分组如下:正常海马神经元+Integrinβ1shRNANC、正常海马神经元+Integrinβ1shRNA2、Sombati癫痫细胞模型组+Integrinβ1shRNANC,Sombati癫痫细胞模型组+Integrinβ1shRNA2,各组神经元均恢复维持培养基后继续培养,通过Westernblotting检测其对海马神经元和Sombati癫痫细胞Integrinβ1的基因沉默效果。结果:经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功,病毒达到有效滴度;Westernblotting证实,重组慢病毒Integrinβ1shRNA2感染海马神经元和Sombati癫痫细胞后Integrinβ1蛋白表达显著下降。结论:成功构建Integrinβ1RNA干扰慢病毒载体,并在新生大鼠海马神经元和Sombati癫痫细胞中实现有效的基因沉默效应。第三部分Integrinβ1沉默后Sombati难治性癫痫细胞模型的FAK依赖相关信号通路蛋白表达变化目的:利用Integrinβ1慢病毒载体转染Sombati癫痫细胞模型,探讨Integrinβ1相关信号通路在致癫痫中的作用及其机制,为进一步阐明癫痫的发病机理提供科学依据。方法:利用NeurobasalMedium无血清神经培养基和B-27因子体外培养SD新生乳鼠的海马神经元,随机分为以下四组:正常海马神经元、Sombati癫痫细胞模型、Sombati癫痫细胞模型+Integrinβ1shRNANC、Sombati癫痫细胞模型+Integrinβ1shRNA2,培养至第11天时,用Integrinβ1shRNANC感染Sombati癫痫细胞模型+Integrinβ1shRNANC组的细胞,用Integrinβ1shRNA2感染Sombati癫痫细胞模型+Integrinβ1shRNA2组的细胞,至培养第14天时,参照Sombati的方法制备体外难治性癫痫模型,对Sombati癫痫细胞模型组、Sombati癫痫细胞模型+Integrinβ1shRNANC组、Sombati癫痫细胞模型+Integrinβ1shRNA2组用低Mg2+的pBRS液培养细胞3h,恢复维持培养基,再继续培养4天,正常海马神经元组则用含有1mMMg2+的pBRS液培养细胞3h,恢复维持培养基,再继续培养4天,各组细胞均采用Westernblotting检测信号通路蛋白Phospho-FAK(Tyr397)、Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1(Ser199/204)/PAK3蛋白表达水平。结果:与Sombati癫痫细胞+Integrinβ1shRNA2组相比,正常海马神经元、Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrinβ1RNANC的Phospho-FAK水平表达升高(P<0.01);与正常海马神经元相比,Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrinβ1RNANC的Phospho-FAK水平表达升高(P<0.01),Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrinβ1RNANC组的Phospho-FAK水平无明显差异;在正常原代海马神经元、Sombati癫痫细胞模型以及转染了Integrinβ1shRNANC、Integrinβ1shRNA2的Sombati癫痫细胞中,各组细胞的Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1(Ser199/204)/PAK3蛋白表达水平无明显变化。结论:Integrinβ1在Sombati癫痫细胞中发挥作用依赖于FAK相关通路的激活,主要是启动了Tyr397磷酸化位点,但与Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和Phospho-PAK1(Ser199/204)/PAK3蛋白的激活无关。
【作者】叶洁梅;
【导师】吴原;
【作者基本信息】广西医科大学,内科学,2014,博士
【关键词】海马神经元;Integrinβ1;Sombati难治性癫痫细胞;RNA干扰;难治性癫痫;Integrinβ1shRNA;Sombati癫痫细胞;FAK信号通路蛋白;

【参考文献】
[1]韩小斌.减量施肥对重庆烤烟生长及产量品质的影响[D].西南大学,植物营养学,2014,硕士.
[2]王琳.新课程体系下中学历史教学改革的困难与对策[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[3]纪科辉.超声波电机精密定位系统及驱动控制研究[D].浙江大学,电机与电器,2004,硕士.
[4]史玉萍.乌鲁木齐县农村剩余劳动力转移影响因素研究[D].新疆农业大学,农村与区域发展(专业学位),2012,硕士.
[5]杨勇.贵州省医学研究生专业思想教育研究[D].遵义医学院,思想政治教育,2012,硕士.
[6]周莹.基于沪深上市公司的多元化经营与企业绩效关系研究[D].山东财经大学,企业管理,2014,硕士.
[7]姜欣欣.不对称Gemini表面活性剂与十二烷基硫酸钠复配体系的性能研究[D].中北大学,应用化学,2014,硕士.
[8]孙宇博.浅谈计算机数据库技术的应用[J].品牌(下半月),2015,02:172.
[9]刘惠瑶.现代汉语称呼语探究[D].河北师范大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[10]张君志.我国中小物流企业融资对策研究[D].辽宁大学,金融学,2012,硕士.
[11]沈桂兰.访谈节目中模糊限制语的顺应论研究[D].福建师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[12]韩军.MSTP在大客户接入中的应用[J].信息网络,2004,09:39-42.
[13]牛玉刚,甘峰浩,胡源.基于压缩感知的拥塞控制机制[J].控制与决策,2015,02:246-250.
[14]李晓雪.测试方法对软件可靠性计算的影响分析[D].浙江理工大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[15]阚欣.高酒精度啤酒的初步研究[D].江南大学,发酵工程,2012,硕士.
[16]肖瑛.基于作业成本法的建筑施工项目成本控制研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[17]朱婷婷.经理权法律制度研究[D].扬州大学,民商法学,2011,硕士.
[18]李达文.参芎葡萄糖注射液对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[D].复旦大学,生物化学与分子生物学,2011,硕士.
[19]窦金启.戏曲动画及其艺术性和传播理念研究[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[20]陈轶平.嘉兴市粮食安全与土壤质量可持续发展研究[D].浙江大学,农业推广(专业学位),2013,硕士.
[21]蒋晓源.悬索桥高大塔柱裂缝仿真及安全性评估分析[D].重庆交通大学,桥梁与隧道工程,2012,硕士.
[22]刘文楠.电影潜台词语用策略研究[D].渤海大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[23]尹英.论我国死刑制度的嬗变[D].山东大学,法律(专业学位),2013,硕士.
[24]王良涛.一类竞争性实施百慕大股本权证实施策略[D].苏州大学,金融数学,2014,硕士.
[25]钱智勇.基于数据挖掘的重点学科专题知识库开发[J].图书馆,2004,03:50-53.
[26]刘宁,孙鹏森,刘世荣,孙阁.WASSI-C生态水文模型响应单元空间尺度的确定——以杂古脑流域为例[J].植物生态学报,2013,02:132-141.
[27]孙超.无权处分合同效力研究[D].郑州大学,法律(专业学位),2013,硕士.
[28]王磊杰.哈尔滨地区猪源致病性大肠杆菌耐药性分析及基因分型研究[D].东北农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[29]周英亭.1990年夏季山东多雨成因分析[J].山东气象.1992(03)
[30]朱文婉.“小红帽”故事原型及其审美流变研究[D].西南大学,美学,2013,硕士.
[31]闻德生.端面配流全开路式多级轴向柱塞泵原理及试验研究[J].液压与气动.1992(02)
[32]徐征.微操作系统中定位控制、人机交互和微量注射问题研究[D].大连理工大学,2003.
[33]苏雨诺.马加小说的东北地域文化书写[D].东北师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[34]曹媛.辐射无线电波的非无线电设备的电磁兼容性研究[D].天津大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[35]夏会琴.基础普惠型养老保险制度及其水平研究[D].厦门大学,社会保障,2014,硕士.
[36]胡萍.服装产品属性对女性消费者品牌态度及其满意的影响研究[D].杭州电子科技大学,企业管理,2013,硕士.
[37]张宪,李文昊,赵章风,钟江.基于ADAMS的单、双轴颚式破碎机性能研究[J].机电工程,2013,11:1317-1322.
[38]何智余.ω-3脂肪酸预防房颤有效性和安全性的Meta-分析[D].兰州大学,内科学(专业学位),2013,硕士.
[39]刘洋.半干法烟气脱硫压力式雾化喷嘴特性研究[D].哈尔滨工业大学,动力工程,2014,硕士.
[40]吴玥.高校BBS对大学生思想政治教育的影响与对策研究[D].西南大学,思想政治教育,2012,硕士.
[41]姜颖.朝鲜韩国文体论研究的对比研究[D].复旦大学,外国语言学及应用语言学,2012,博士.
[42]朱红.早期西方马克思主义整体性问题研究[D].西安科技大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[43]郝增坤.磺胺氯吡嗪钠—二甲氧苄啶溶液在鸡的残留消除研究[D].扬州大学,基础兽医学,2012,硕士.
[44]宋彤.先秦民族教育交流活动研究[D].曲阜师范大学,教育史,2013,硕士.
[45]马洪芳,王小蕊,江荣岩,张长存.染料敏化乙炔黑-TiO_2复合多孔薄膜电极电性能研究[J].功能材料,2015,03:3077-3081.
[46]杨冬妮.淮安废黄河旅游开发初步研究[D].扬州大学,旅游管理,2011,硕士.
[47]叶文明.大鼠退变椎间盘中环氧化酶-2、缺氧诱导因子-1α的表达及其与血管生成的关系[D].南方医科大学,骨外科学,2012,硕士.
[48]孙玺媛.树舌多糖GF对小鼠HepA瘤基因组甲基化及细胞凋亡的影响[D].黑龙江中医药大学,中西医结合基础,2004,硕士.
[49]李冯刚.基于鞅分析的随机美式期权定价问题研究[D].哈尔滨理工大学,应用数学,2012,硕士.
[50]陈晓鹏.碳、氮添加对藏北高寒草甸碳、氮平衡的影响[D].兰州大学,草业科学,2013,硕士.

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