低温胁迫下番茄PSII捕光天线蛋白基因LeLhcb2的功能分析

【摘要】低温是一个严重的环境胁迫因子,它影响作物的生长发育,并导致产量和品质的降低。低温胁迫下植物光合碳同化能力下降,即便是在弱光条件下也会产生过剩光能,致使活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)大量积累,引起植物光系统II(photosystemII,PSⅡ)的光抑制,甚至光氧化。植物在进化过程中,形成了多种防御机制以适应环境的变化,包括PSⅡ捕光天线蛋白调节光能在两个光系统间的分配,促进过剩光能的耗散,降低ROS的积累,从而保护植物光合机构免受过剩激发能的破坏。因此,探讨低温胁迫下捕光色素蛋白复合体(LHC)蛋白对植物低温抗性的影响具有重要的理论意义和实践价值。本实验从番茄品种中蔬6号叶片中分离到了一个PSⅡ捕光天线蛋白基因LeLhcb2,并以过表达该基因的烟草为材料,研究了过表达LeLhcb2对转基因烟草低温耐性的影响,主要结果如下：(1)根据NCBI查得叶绿素a/b绑定蛋白基因的全长mRNA序列(GenBank注册号：AK246535.1).利用DNAman软件设计特异引物,RT-PCR的方法获得基因的全长cDNA。该基因全长892bp,开放阅读框798bp,编码266个氨基酸。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析发现该基因属于叶绿素a/b绑定蛋白超家族,具有叶绿素a/b绑定结构域。与拟南芥12个叶绿素a/b绑定蛋白比对结果显示该基因氨基酸序列与拟南芥AtLhcb2同源性最高(约88%)。与GenBank中其它已知植物LHCB2氨基酸序列比对结果显示该基因氨基酸序列与盐芥、衣藻、豌豆、杨树、景天以及卷柏等植物的LHCB2高度同源。DNAman软件聚类分析结果显示,番茄的LHCB2与杨树和景天的LHCB2最为聚类。以上结果显示我们克隆到的基因是番茄PSⅡ捕光天线蛋白基因Lhcb2,我们将其命名为LeLhcb2。(2)拟南芥原生质体瞬时表达p35S-LeLhcb2-GFP融合蛋白,并通过激光共聚焦显微镜观察发现GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明LeLhcb2蛋白定位于叶绿体。(3)半定量PCR和Northern杂交分析表明,LeLhcb2基因在叶片中表达量最高。qRT-PCR和Northern杂交分析表明LeLhcb2的表达受4℃、NaCl诱导,受渗透胁迫和氧化胁迫抑制。此外,LeLhcb2的表达还受到信号物质的影响。(4)成功构建了pET-LeLhcb2原核表达载体,用IPTG诱导LeLhcb2在大肠杆菌BL21中表达,将诱导表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗体,测得效价为1：10000,Western杂交表明,低温和高盐均诱导LeLhcb2在蛋白水平的表达。(5)将LeLhcb2的编码区连入pBI121载体,构建了LeLhcb2的过表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得正义转基因烟草植株,并通过PCR、qRT-PCR以及Western杂交的方法检测具有卡那抗性的转基因植株,结果表明成功获得了LeLhcb2过表达的转基因植株。(6)正常生长条件下,野生型与正义转基因植株表型上无明显差别。但是,低温胁迫条件下,转正义基因烟草幼苗的存活率和生长量优于野生型,表现出更高的鲜重和叶绿素含量。低温胁迫下,转基因烟草成苗也表现出更好的生长表型。体现在较高的净光合速率(Pn)和较低的细胞膜受伤害程度。这些结果表明过表达LeLhcb2基因提高了转基因烟草植株的低温耐性。(7)在低温胁迫条件下,转正义烟草植株与野生型相比,表现出较高的Fv/Fm,NPQ和D1蛋白含量,说明转基因烟草PSⅡ的光抑制程度较轻。(8)低温胁迫条件下,转正义基因烟草较野生型能维持较低的O2-和H2O2含量,并且这种较低的ROS积累不是由于在低温条件下转基因烟草具有更高的APX和SOD酶活性引起的。
【作者】邓永胜；
【导师】孟庆伟；
【作者基本信息】山东农业大学，植物学，2014，博士
【关键词】低温胁迫；捕光色素蛋白复合体；绿素a/b绑定蛋白；活性氧；番茄；转基因烟草；

【参考文献】
[1]周立君.电子管家项目商业计划可行性研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[2]杨超.沱沱河地区宁多岩群变质岩的特征及意义[J].资源环境与工程.
[3]王毅曼.影响儿童钢琴学习动机的因素及应对策略[D].华中师范大学,音乐学,2013,硕士.
[4]曹文涛.课证融合在高职课程教学中的实践研究[D].宁夏大学,教育（专业学位）,2014,硕士.
[5]史喜军.交通运输可持续发展理论与应用研究[D].河海大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[6]陈臣.铁路信号RSSP-1安全通信协议在既有线站间安全信息传输中的应用研究[D].北京交通大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[7]赵青.基于多模态整合的小品幽默生成机制研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[8]闫迎春.建国初期国家形象的构建研究（1949-1956）[D].华东交通大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2014,硕士.
[9]史杰.新疆阜康断裂晚第四纪活动性研究[D].中国地震局兰州地震研究所,构造地质学,2011,硕士.
[10]徐春华.中学语文美育研究[D].华东师范大学,教育,1999,硕士.
[11]张亚民.锦山中学历史生成性教学的现实状况和实施策略研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[12]王惠玲.论终审判决的权威性[D].安徽大学,法律,2003,硕士.
[13]朱艺峰.初中生解题错误归类及教学对策[D].杭州师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[14]姚晶晶.中日书籍交流中的柳芳《唐历》研究[D].浙江工商大学,日语语言文学,2013,硕士.
[15]张辉.施硫与灌水对冬小麦耗水特性、物质积累及产量的影响[D].河南农业大学,作物营养生理,2012,硕士.
[16]冯洁.内镜对上消化道粘膜下肿瘤诊断及治疗价值的临床研究[D].兰州大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[17]王铭东.论民事执行检察监督[D].河北师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[18]陈雪莹.针刺左侧支正穴对健康青年大脑中动脉血流动力学影响的研究[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[19]谢辉.犬骨髓基质干细胞体外培养及与Bio-gide胶原膜复合培养的实验研究[D].大连大学,外科学,2012,硕士.
[20]韩庆珏.深海履带式集矿机打滑及路径跟踪控制问题研究[D].中南大学,机械工程,2014,博士.
[21]秦祯.企业集团财务管理体制研究[D].内蒙古大学,会计,2014,硕士.
[22]孔旭.基于物联网技术的固体废物管理监控系统的研究[D].沈阳理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[23]陈科.程序流程图结构分析与识别技术的研究与实现[D].西安电子科技大学,计算机软件与理论,2011,硕士.
[24]周元,张斌斌,莫玲娇.余额宝真的是块“宝”吗[J].企业家天地(下半月刊),2014,04:96-97.
[25]斯琴高娃.新时期青海蒙古文小说乡土性研究[D].内蒙古大学,中国少数民族语言文学,2013,硕士.
[26]陈莹.投资者情绪对我国股价的影响[D].苏州大学,金融学,2014,硕士.
[27]沈曹凯.城镇化进程中城中村治理改革研究[D].华中师范大学,公共管理,2014,硕士.
[28]本报记者周慧迪本报通讯员孙岩维.铿锵步履跨越崛起[N].济宁日报,2014-12-26006.
[29]佟雪峰.基于车辆动力学的空气悬架系统参数匹配的研究[D].沈阳理工大学,车辆工程,2012,硕士.
[30]吴振庆,张同斌,于宝莲,李成亮,李岚.基于趋势分析的健康状况调查模型的探讨[J].微机发展,2001,03:65-67.
[31]杨晓宏,田瑞,马淑娟,吕海莉.叠式空气隙膜蒸馏组件膜污染实验研究[J].环境工程学报,2013,03:963-968.
[32]宋林艳.高等教育大众化背景下大学生的择业观研究[D].中北大学,思想政治教育,2013,硕士.
[33]卫其巍.大豆种子中菜豆荚斑驳病毒的RT-LAMP检测和大豆花叶病毒表达载体的构建[D].南京农业大学,植物病理学,2013,硕士.
[34]袁静.面向设备故障诊断的数据挖掘关键技术研究与实现[D].西安电子科技大学,教育技术学,2012,硕士.
[35]刘宇平.陶俑艺术在三维动画中的实现[D].北京印刷学院,设计艺术学,2013,硕士.
[36]何庆玲.猪Stra8基因的克隆、表达和体外转染精原干细胞的初步研究[D].扬州大学,动物遗传育种与繁殖,2012,硕士.
[37]成斌.新疆“汉考民”现象研究[D].新疆大学,民族学,2013,硕士.
[38]慕道洲.新型双发射ECL染料标记物研究[D].大连理工大学,应用化学,2013,硕士.
[39]王宇.基于设计方案的公共建筑全生命周期能耗分析与评价[D].清华大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[40]范文英.旅游企业文化与制度执行的互动机制研究[D].湖南师范大学,旅游管理,2013,硕士.
[41]陈俊阳.麻醉方式与老年人全髋关节置换后深静脉血栓发生率的分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[42]赵华洲.NHE-1基因在人肝癌细胞增殖/凋亡调控中的作用[D].第四军医大学,外科学,2004,硕士.
[43]曾星.国际商事仲裁前调解制度研究[D].浙江工商大学,国际法学,2013,硕士.
[44]何晓峰,王钢,李海锋.调度自动化系统增强型数据仓库平台构建及应用[J].电力系统自动化,2008,04:81-84+102.
[45]张全娜.论无单放货的责任归属和风险防范[D].安徽大学,国际商务,2013,硕士.
[46]张娜.纳米功能材料的组装与性能研究[D].华东师范大学,2010.
[47]邵伟.完善我国出口信用保险制度的研究[D].东北财经大学,国际贸易,2003,硕士.
[48]金立翡.动车铆钉焊缝连接件强度的有限元分析[D].大连理工大学,工程力学,2013,硕士.
[49]孙治国.玉米加工副产物发酵生产饲料的研究[D].齐鲁工业大学,轻工技术与工程,2014,硕士.
[50]庄俐,吴林妃.2006-2013年度国家自然科学基金青年科学基金项目资助情况剖析[J].科技通报,2014,08:240-243.