抗能量药物柠檬酸钠对胃癌细胞增殖的影响及其作用机制研究

【摘要】研究背景和目的胃癌是常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。胃癌的治疗是世界性的难题，近年来随着以外科手术为主的综合治疗的应用，其预后有所改善，但5年生存率仍不满意。为了满足胃癌这种复杂疾病的治疗要求，有必要寻找新型有效的抗肿瘤药物。肿瘤细胞主要依赖糖酵解产生ATP获得能量，抑制糖酵解可诱导细胞凋亡，以抗肿瘤能量代谢为治疗靶点的药物称为抗能量药物，柠檬酸钠（SCT）是其中的代表。磷酸果糖激酶1（PFK-1）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）是催化糖酵解途径的关键酶，其中PFK-1的调控作用最强，若能抑制PFK-1活性，则能抑制糖酵解。研究资料显示，SCT作为PFK-1的抑制剂，能通过与PFK-1的抑制性结合位点结合从而抑制该酶的活性。此外还有研究证实，当肿瘤细胞的糖酵解被抑制、ATP枯竭时可产生持续性的DNA降解，导致肿瘤细胞线粒体通透性增强，通过释放细胞色素C（Cyt-C）、激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）而诱导细胞凋亡。细胞凋亡的启动和进行受到精确调控，具有独特的信号系统。线粒体是细胞能量的代谢中心，线粒体通路作为凋亡信号传导的重要通路，受多种凋亡基因或蛋白调控，如Bcl-2家族等。Cyt-C的释放是线粒体凋亡通路激活的标志。通过对这些凋亡基因或蛋白的研究，能为阐明药物的作用机制提供依据。本课题前期研究已经证明SCT在体外可抑制胃癌细胞增殖，但其作用机制及其与糖酵解有无联系尚不清楚；此外，SCT在体内对人胃癌裸鼠移植瘤的生长有无抑制作用及其机制未见报道。通过前期实验，我们推测SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起凋亡基因或蛋白表达改变，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加,活化caspase来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌生长的作用。为了证实这一推测，本实验通过应用人胃癌细胞株SGC-7901和人胃癌裸鼠移植瘤模型，研究SCT在体外和体内对胃癌细胞增殖的影响，并探讨其作用机制，以期为胃癌的药物治疗提供新的实验依据和研究思路。研究内容第一章柠檬酸钠对胃癌细胞增殖的影响及其作用机制实验方法培养人胃癌细胞株SGC-7901，随机分为5组：SCT低、中、高浓度组（5mmol/L﹑10mmol/L﹑20mmol/L），阳性对照5-FU组（0.5mmol/L）及空白对照组，分别对其用药，观察药物对胃癌细胞增殖的影响。采用倒置显微镜观察细胞生长情况，流式细胞仪技术检测细胞凋亡和周期的改变，6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法检测细胞PFK-1、HK、PK活性，分光光度法检测糖酵解终产物乳酸的含量，RT-PCR检测凋亡相关基因mRNA的表达。实验结果1、显微镜观察结果：用药24h、48h后，低、中、高浓度SCT及5-FU对胃癌细胞的增殖均有显著抑制作用，SCT的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性。SCT高浓度组的活细胞数目在24h与5-FU组比较，差异无统计学意义(P＞0.05),但在48h，SCT高浓度组的活细胞数目大于5-FU组(P＜0.05)。在24h，SCT高浓度组的细胞增`殖抑制率与5-FU组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但在48h，SCT高浓度组的细胞增殖抑制率小于5-FU组(P＜0.05)。SCT各浓度组及5-FU组的胃癌细胞均出现凋亡形态学改变。2、流式细胞仪检测结果：用药24h、48h后，SCT各浓度组及5-FU组分别与空白对照组比较，细胞凋亡率显著增高(P＜0.05)，SCT各浓度组的细胞凋亡率随SCT浓度增加或用药时间延长而增高。在24h，SCT高浓度组的细胞凋亡率与5-FU组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但在48h,5-FU组的细胞凋亡率高于SCT高浓度组(P＜0.05)。SCT各浓度组及5-FU组细胞的G2/M期上升明显，且均能见到亚二倍体凋亡峰，而空白对照组细胞的G2/M期上升不明显，未检测出亚二倍体凋亡峰。3、PFK-1、HK、PK活性及乳酸含量检测结果：用药24h、48h后，SCT各浓度组细胞的PFK-1活性与乳酸含量显著低于5-FU组和空白对照组（P＜0.05），SCT各浓度组细胞的PFK-1活性与乳酸含量随SCT浓度增加或用药时间延长而降低。5-FU组的PFK-1、HK、PFK活性及乳酸含量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。SCT各浓度组细胞的HK、PK活性在24h、48h分别与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4、RT-PCR检测结果：用药24h后，SCT各浓度组Bax、Cyt-CmRNA的表达显著高于空白对照组，Bcl-2、Bcl-xLmRNA的表达显著低于空白对照组（P＜0.05）；SCT各浓度组Bax、Cyt-CmRNA的表达随SCT浓度增加而上调，Bcl-2、Bcl-xLmRNA的表达随SCT浓度增加而下调。5-FU组BaxmRNA的表达低于SCT高浓度组，但高于中浓度组（P＜0.05）；5-FU组Cyt-C、Bcl-2、Bcl-xLmRNA的表达与SCT中浓度组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验结论SCT对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖有较强的抑制作用。SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起促凋亡基因Bax表达增强、抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表达降低，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加，来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞增殖的作用。实验结果提示SCT可能是一种有效的抗肿瘤药物，值得进行体内研究。第二章柠檬酸钠对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及其作用机制实验方法采用人胃癌细胞株SGC-7901构建人胃癌裸鼠移植瘤模型，随机分为5组：SCT低、中、高剂量组（7.5mg/kg﹑15mg/kg﹑30mg/kg），阳性对照5-FU组（0.35mg/kg）、阴性对照生理盐水组（NS），每组12只，分别用药连续注射两周，NS组仅注射NS，观察SCT对移植瘤生长的影响。采用电镜进行细胞超微结构观察，TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡，6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法检测移植瘤PFK-1、HK、PK活性，分光光度法检测糖酵解终产物乳酸的含量，应用免疫组织化学法和蛋白印记法检测凋亡相关蛋白表达，利用生化分析仪检测裸鼠肝肾功能及血液学指标，镜下观察裸鼠肝肾组织切片。实验结果1、移植瘤生长的抑制：SCT各剂量组及5-FU组裸鼠的肿瘤重量、体积、抑瘤率分别与NS组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中，SCT高剂量组裸鼠的肿瘤重量、体积、抑瘤率分别与5-FU组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。2、透射电镜检测结果：SCT各剂量组及5-FU组裸鼠的移植瘤细胞在镜下可见典型的凋亡形态学改变：如细胞形状缩皱，核形缩小，染色质浓缩边集，内质网碎裂，胞质内有大小不等的空泡，部分线粒体增生水肿、出现空泡样变性，嵴分辨不清，可见典型的凋亡小体。而NS组裸鼠的移植瘤细胞大小均一，细胞核较大且核仁明显，未见染色质浓缩边集和凋亡小体。3、TUNEL法检测凋亡结果：SCT各剂量组裸鼠移植瘤细胞的平均凋亡指数分别为：SCT低剂量组37.52±5.19%、SCT中剂量组48.35±4.83%、SCT高剂量组57.23±6.57%、5-FU组49.18±7.64%、NS组4.32±0.69%；SCT各剂量组及5-FU组细胞的平均凋亡指数分别与NS组比较，差异有统计学意义；SCT组间的两两比较，差异有统计学意义，SCT各剂量组细胞的平均凋亡指数随SCT剂量增加而上升；5-FU组细胞的平均凋亡指数低于SCT高剂量组（P＜0.05），但其与SCT中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4、移植瘤PFK-1、HK、PK活性及乳酸含量检测结果：SCT各剂量组的PFK-1活性及乳酸含量显著低于5-FU组和NS组（P＜0.05），SCT各剂量组的PFK-1活性及乳酸含量随SCT剂量增加而降低，存在量效关系。5-FU组的PFK-1、HK、PK活性及乳酸含量和NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。SCT各剂量组的HK、PK活性与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）5、免疫组化结果：SCT各剂量组及5-FU组cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9蛋白表达均高于NS组（P＜0.05），其中，5-FU组cleavedcaspase-3蛋白表达低于SCT高剂量组但高于SCT中剂量组，5-FU组cleavedcaspase-9蛋白表达高于SCT高剂量组（P＜0.05），SCT各剂量组cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9蛋白表达随SCT剂量增加而上调（P＜0.05）。6、蛋白印记法检测结果：SCT各剂量组Bax、Cyt-C蛋白表达显著高于NS组，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达显著低于NS组（P＜0.05）；SCT各剂量组Bax、Cyt-C蛋白表达随SCT剂量增加而上调，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达随SCT剂量增加而下调（P＜0.05）。5-FU组Bax、Bcl-xL蛋白表达与SCT高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），5-FU组Bax蛋白表达高于SCT中剂量组，5-FU组Bcl-xL蛋白表达低于SCT中剂量组（P＜0.05）。5-FU组Cyt-C、Bcl-2蛋白表达与SCT中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），5-FU组Cyt-C蛋白表达低于SCT高剂量组，5-FU组Bcl-2蛋白表达高于SCT高剂量组（P＜0.05）。7、裸鼠肝肾功能和血液学检测结果：SCT各剂量组裸鼠的谷丙转氨酶、白蛋白、总胆红素、尿素氮、肌酐与NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；5-FU组与NS组比较，其谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐均不同程度升高，白蛋白降低（P＜0.05），但总胆红素无显著差异（P＞0.05）。SCT各剂量组裸鼠的白细胞、血小板、血红蛋白与NS组比较，差异无统计学意义，5-FU组裸鼠的白细胞、血小板与NS组比较，均显著降低（P＜0.05），但血红蛋白无显著差异（P＞0.05）。裸鼠肝肾组织切片显示，5-FU组裸鼠的肝肾切片可见坏死组织，而SCT各剂量组及NS组裸鼠的肝肾切片未见明显异常。实验结论SCT对人胃癌裸鼠移植瘤的生长有较强的抑制作用。SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起促凋亡蛋白Bax表达增强、抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达降低，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加,活化caspase-3和caspase-9来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌生长的作用。SCT在裸鼠体内显示出较高的药物安全性。全文研究结论本研究首次报道抗能量药物SCT在体外对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖及体内对人胃癌裸鼠移植瘤的生长均有较强的抑制作用，在实验剂量范围内，SCT与传统化疗药5-FU的疗效相似。SCT可能是通过抑制PFK-1活性从而抑制糖酵解，引起促凋亡蛋白Bax表达增强、抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达降低，激活线粒体通路引起Cyt-C释放增加,活化caspase-3和caspase-9来发挥其诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌生长的作用。SCT在裸鼠体内显示出较高的药物安全性，其有可能成为一种新型有效的抗肿瘤药物。本研究为胃癌的药物治疗提供了新的实验依据和研究思路。
【作者】冼书林；
【导师】陆云飞；
【作者基本信息】广西医科大学，胃肠腺体外科，2014，博士
【关键词】胃癌；柠檬酸钠；糖酵解；磷酸果糖激酶1；凋亡；

【参考文献】
[1]任耀新.高频振动时效装置的研究[D].浙江大学,2006.
[2]刘颖.感知学习风格对通道效应的影响研究[D].河北大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[3]田小平.中原经济区建设的关键——发展创业型经济[J].中国商贸,2015,02:104-106.
[4]朱冰春.烟酸的绿色合成与催化剂研究[D].浙江工业大学,工业催化,2004,硕士.
[5]吴恒青.锂原子掺杂共轭及非共轭体系的结构和非线性光学性质的理论研究[D].东北师范大学,2014.
[6]陈琳.汉语小句宾语句中代词主语和空主语的第二语言习得研究[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[7]李燕华.我国产业结构变动对潜在经济增长率的影响分析[D].首都经济贸易大学,国民经济学,2014,硕士.
[8]胡向东,鲜继清.论商业智能[A].中国自动化学会智能自动化专业委员会.2003年中国智能自动化会议论文集（下册）[C].中国自动化学会智能自动化专业委员会:,2003:5.
[9]陈寅.认知网络中二级用户访问策略的研究[D].湖北大学,无线电物理,2012,硕士.
[10]李国元.phonerent手机租赁公司关系营销策略分析[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[11]夏雪伟.多效唑对两种大麻（Cannabis sativa L.）生长及镉吸收的影响[D].南京农业大学,植物学,2012,硕士.
[12]焦磊涛.基于气动肌肉驱动的仿蛙腿跳跃机构控制系统研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[13]张寻.河北省高校竞技健美操运动的现状与研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[14]杨丹.基于MTS理论的多团队学习和过程绩效的关系研究[D].浙江工商大学,企业管理,2014,硕士.
[15]张蒙.《每日电讯报》金价新闻汉语翻译实践报告[D].河北师范大学,翻译,2014,硕士.
[16]张晓楠.城市高中薄弱校学生对三角函数定义理解情况的调查[D].东北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[17]郭小燕.幼师女生厌学心理分析[D].内蒙古师范大学,心理健康教育（专业学位）,2013,硕士.
[18]张萍.基于QFD的银行客户满意度分析[D].青岛大学,金融学,2013,硕士.
[19]刘晓菲.基于长时序多源遥感数据的植被覆盖度反演与变化检测研究[D].中国矿业大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[20]郑丽红.硕士研究生毕业设计报告[D].中国音乐学院,音乐学,2014,硕士.
[21]林立东.羊栖菜对重金属铜的吸附及生理响应[D].东北林业大学,细胞生物学,2014,博士.
[22]吴维明.导电高分子聚吡咯传感器研究[D].浙江大学,生物医学工程,2004,硕士.
[23]杨波.商品漂绿的中国本土特征与治理[J].河南社会科学,2014,08:19.
[24]邓立红.热带假丝酵母发酵商品木糖与稻秸水解液生产木糖醇的研究[D].北京化工大学,生物化工,2006,博士.
[25]孟倩.丹参组织培养及原生质体分离的研究[D].河南科技大学,植物学,2013,硕士.
[26]史昱.几类方程有限体积元方法的数值模拟[D].山东师范大学,应用数学,2003,硕士.
[27]王芳,梁春生,徐大亮,曹慧群,孙宏元,罗仲宽.锂空气电池的研究进展[J].无机材料学报,2012,12:1233-1242.
[28]林向义.虚拟现实技术在电力培训中的应用[D].大庆石油学院,计算机应用技术,2004,硕士.
[29]黄金龙.基于改进RBF神经网络的模拟电路故障诊断技术研究[D].重庆大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[30]唐功友,孙亮.非线性相似组合大系统最优控制的逐次逼近过程[J].控制与决策,2005,01:82-86+90.
[31]张向阳.滴灌带成型组件设计与挤出螺杆机筒磨损修复技术研究[D].浙江海洋学院,农业机械化（专业学位）,2014,硕士.
[32]文菁.地球科学相关论文摘要[J].测绘信息与工程,2005,01:50-51.
[33]张朋.重庆市开县主要矿产资源调查评价[D].辽宁工程技术大学,地质工程,2012,硕士.
[34]陈立勤.黑死病前后的圣塞巴斯蒂安题材图像研究[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[35]曲洺皞.吉林省白城地区农村体育公共服务现状调查及其策略选择[D].沈阳体育学院,体育人文社会学,2014,硕士.
[36]吴民许,杨奕.《消费者权益保护法》修订中的金融消费者保护问题[J].中国流通经济,2010,12:74-76.
[37]梁思懿.设计观念与影像表达[D].北京林业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[38]周华斌.论现代水彩画的实验性特征[D].湖南师范大学,美术学,2013,硕士.
[39]冯吉福.中美所得税会计比较及对我国的启示和借鉴[D].沈阳工业大学,会计学,2003,硕士.
[40]李家伟.1950-1979年甘肃省靖远县农田水利建设研究[D].西北师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[41]付体鹏.猪样品中20种禁用兽药质谱检测方法的优化研究[D].西南大学,预防兽医学,2013,硕士.
[42]叶小丽.中小企业客户关系管理的实施及主要成功因素分析[D].四川大学,2003.
[43]孙剑.新型无卤阻燃螺环磷腈环氧树脂的设计合成及固化动力学、热性能和阻燃性能研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[44]孔令甫.介绍两种容易研制的交流调速装置[J].冶金自动化,1989,03:14-18.
[45]杜鹏宇,程树森,滕召杰.高炉无料钟炉顶布料料流轨迹检测与三维图像重建[J].冶金自动化,2009,06:1-6.
[46]王永军.流域水资源统一管理体制研究[D].天津大学,公共管理,2004,硕士.
[47]仲晓飞.财政监督问题研究[D].东北财经大学,财政学,2003,硕士.
[48]王一玮.大鼠前部缺血性视神经病变模型的建立及视神经损伤的动态观察[D].北京协和医学院,眼科学,2014,博士.
[49]刘榕.企业数据仓库的建立和实现[J].中国统计,2002,04:37.
[50]钟锦定.无线接收机中80dB自动增益控制电路的设计[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2010,硕士.