养殖虾蟹疫病免疫防控的初步研究

【摘要】虾蟹养殖是世界水产养殖业的重要组成部分，但病毒和细菌性疫病的频繁爆发严重影响了该产业的健康发展，发展有效的疫病防控策略迫在眉睫。本研究选取凡纳滨对虾（Litopenaesvannamei）和中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）为实验对象，研究了CpG寡聚核苷酸（CpGODN）、表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、地衣次级代谢产物红粉苔酸对虾蟹的免疫保护作用及其作用机制，利用碳纳米管和壳聚糖优化了免疫活性物质的导入途径，探讨了不同免疫增强剂在养殖虾蟹疫病防控中的应用前景。将大规模发酵制备的CpGODN和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母（VP28-yl）分别拌饲投喂凡纳滨对虾15天，发现在WSSV侵染后，CpGODN和VP28-yl投喂组对虾的死亡率和体内病毒拷贝数均显著低于对照组。CpGODN投喂组对虾的细胞凋亡水平呈现先升高后降低的趋势，而VP28-yl投喂组对虾与对照组相比则一直维持较低水平，提示VP28-yl能抑制由WSSV侵染而引起的细胞凋亡。同时CpGODN投喂组对虾血淋巴细胞的呼吸爆发水平和Dicer、STAT、prophenoloxidase的mRNA表达量显著增加，VP28-yl投喂组对虾LGBP表达量显著增加，以上结果表明CpGODN和表面展示VP28的耶罗维亚酵母能通过不同的作用机制增强凡纳滨对虾抵御WSSV侵染的能力。田间试验发现投喂CpGODN和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母30天后，凡纳滨对虾的相对存活率显著提高，且CpGODN投喂组对虾的生长速率显著增加，进一步证明CpGODN和VP28-yl对养殖对虾病毒性疫病的防控具有显著作用，具有在养殖生产中推广使用的前景。发现经嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌拌饲投喂21天的中华绒螯蟹在嗜水气单胞菌注射处理后的死亡率较对照投喂组显著降低，其血细胞吞噬能力及酚氧化酶、过氧化氢酶和溶菌酶活力水平显著增强，C型凝集素、prophenoloxidase、peroxinectin和LGBP基因的mRNA表达量显著上升。这表明嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌能激活中华绒螯蟹的固有免疫系统，可作为候选的免疫增强剂，应用于养殖虾蟹类细菌性疫病的免疫防控。体外抑菌实验发现光肺衣（Lobariakurokawae）次级代谢产物红粉苔酸（lecanoricacid）对嗜水气单胞菌具有显著的抑制作用。发现10μgmL-1红粉苔酸注射处理中华绒螯蟹后，其新生血淋巴细胞数量显著增加，血淋巴细胞吞噬活性和酚氧化酶、溶菌酶的活性显著上升，而一氧化氮的含量显著降低，表明红粉苔酸具有较强的抗氧化作用，能增强中华绒螯蟹免疫防御能力，有效抵御嗜水气单胞菌的侵染。利用碳纳米管和壳聚糖等纳米载药载体，对免疫活性物质的导入途径进行了优化。发现碳纳米管-病毒灵在对虾原代血淋巴细胞中发挥了良好的抗病毒作用，与WSSV共孵育后，检测到100μgmL-1碳纳米管-病毒灵处理组血细胞中病毒拷贝数达到(1.20±0.21)×106copiesng-1，显著低于对照组的(1.95±0.16)×106copiesng-1，能在凡纳滨对虾和中华绒螯蟹细胞中实现自由穿膜，导入效率接近于100%；壳聚糖-CpGODN和壳聚糖-dsRNAie1通过内吞作用被摄入到对虾细胞内并在胞内呈点状分布，且壳聚糖载体具有良好的缓释作用。表明碳纳米管和壳聚糖可辅助将免疫活性物质高效导入虾蟹细胞，不产生明显细胞毒性，因而可作为虾蟹类免疫增强剂的候选导入载体。综上所述，CpGODN、表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、红粉苔酸等免疫活性物质能激活虾蟹类固有免疫系统，增强机体抵御WSSV和嗜水气单胞菌侵染的能力，可作为候选免疫增强剂应用于养殖甲壳动物疫病的免疫防控；碳纳米管和壳聚糖等纳米载药载体的应用能实现免疫活性物质在虾蟹细胞中的高效导入。研究结果对于发展虾蟹疫病免疫防控新技术具有重要理论和实践意义。
【作者】衣启麟；
【导师】宋林生；
【作者基本信息】中国科学院研究生院（海洋研究所），海洋生物学，2014，博士
【关键词】凡纳滨对虾；中华绒螯蟹；固有免疫；免疫活性物质；导入途径；疫病防控；

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