HO-1基因转染脂肪间充质干细胞在支气管哮喘中的作用及机制研究

【摘要】第一部分：脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的：分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞（Adipose-derivedmesenchymalstemcells，ADSCs），通过流式细胞技术和干细胞多能分化诱导技术对干细胞进行鉴定，掌握体外干细胞培养技术，了解干细胞的生物学特性。材料与方法：用无菌技术切取6-8w的BALB/c小鼠腹股沟及腹部脂肪组织，用I型胶原酶消化获得ADSCs，将细胞培养在含10%胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的L-Dulbeeo改良的eagle培养液（Dulbeco’smodifiedeaglemedium，DMEM）培养基中，采用单纯贴壁法对鼠ADSCs进行分离，并在体外进行ADSCs传代培养、纯化。用倒置显微镜每天观察细胞生长，计算细胞贴壁率，绘制ADSCs的生长曲线，用流式细胞仪对ADSCs表面标志物CD90、CD44、CD11b、CD45进行鉴定，然后用不同的诱导液诱导ADSCs向成脂肪、成骨、成软骨细胞分化，并采用油红O染色、改良Gomori钙钴法、VonKossa染色、阿尔新蓝染色等方法进行鉴定。结果：接种后第2d，细胞开始稀疏地贴附于培养瓶的表面，呈纺锤形，少数呈三角形、多角形。在第3d换液时，发现大多数细胞均已贴壁。至第5d左右，细胞呈集落样生长，形态呈成纤维细胞样梭形细胞。至第9-10d，细胞集落生长至80%融合，细胞呈均一的梭形，成旋涡状排列，2w左右，细胞可长满瓶底。传代细胞以均匀分布的方式生长，5-7d就几乎完全融合，1w左右即可以传代一次。细胞接种后2h左右，即有部分细胞出现贴壁，贴壁率为29.4%±1.3%，24h的贴壁率97.3%±1.8%。接种后第1d即有细胞生长，但前3d细胞生长比较缓慢，第4-8d细胞生长显著加快，至第8d，细胞生长接近融合。传至3代后，细胞的形态呈现均一的长梭形、成纤维状。经测定CD90、CD44阳性细胞达到96.6%和85.3%；CD11b、CD45阳性细胞均为0.5%，在不同的诱导环境下，可分化为成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。表明所得细胞为ADSCs。结论：通过I型胶原酶和单纯贴壁法可以体外获得大量ADSCs，具有较强的增殖能力，细胞表面标志CD90、CD44阳性，CD11b、CD45阴性，体外具有很强的多向分化潜能。第二部分：携带HO-1基因慢病毒的包装和ADSCs的转染目的：制备携带血红素氧化酶-1（Hemeoxygenase-1，HO-1）基因的慢病毒载体，并对其进行测序鉴定，在293T细胞中进行慢病毒包装，得到高滴度的携带HO-1基因的慢病毒，进行ADSCs的转染。材料与方法：从新鲜脾脏组织中抽提出小鼠总RNA，将总RNA反转录合成cDNA。根据小鼠HO-1基因（GeneBank序号：NM010442.2），设计并合成HO-1基因引物，利用人工合成的引物，采用RT-PCR技术钓取目的基因HO-1的cDNA片段，再将目的基因片段与pMD18T载体连接，再将酶切线性化的pMD18T-HO-1与酶切线性化的pCDH-MCS-EF1-GFP-Puro载体连接，其产物转化感受态细菌XL10-gold。对长出的克隆先进行菌落鉴定，挑取符合预期的阳性克隆进行测序。然后在293T细胞内，进行慢病毒的包装，收集、浓缩病毒颗粒并检测病毒滴度，最后将携带HO-1基因的慢病毒转染ADSCs，并运用RT-qPCR和Western-Blot的方法检测ADSCs的HO-1mRNA和HO-1蛋白的表达情况。结果：琼脂糖电泳及测序证实成功构建了重组pCDH-CMV-HO-1载体，HO-1基因被成功导入pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro载体，在293T细胞内，成功地包装成携有HO-1基因的慢病毒，病毒滴度为3×108TU/ml。成功地将携有HO-1基因的慢病毒转染至ADSCs，运用RT-qPCR和Western-Blot的方法能在ADSCs检测到高水平HO-1mRNA和HO-1蛋白的表达。结论：成功构建了携带HO-1基因的慢病毒，并成功地转染到ADSCs中，为下一步的小鼠哮喘模型体内实验提供优质的、HO-1基因修饰的ADSCs来源。第三部分：转HO-1基因的ADSCs治疗支气管哮喘的实验研究目的：以支气管哮喘小鼠为模型，研究转HO-1基因的ADSCs在支气管哮喘中的治疗作用，及其对参与哮喘发病的细胞因子的影响，比较单用ADSCs和转HO-1基因的ADSCs在哮喘中的作用，确定HO-1在哮喘肺部的抗炎作用，评估基因疗法在支气管哮喘治疗中的可行性。材料与方法：选用雌性BALB/c小鼠32只，体重18-22g，随机将小鼠分为：对照组、哮喘组、ADSCs/HO-1组和ADSCs组。哮喘组运用卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）致敏并激发，制作小鼠哮喘动物模型，在实验d0、d7、d14天，给哮喘组小鼠注射OVA致敏液200μl，从d21天到d27天给予小鼠吸入3%的OVA溶液，每次30min，每天一次，在d20天，哮喘组经尾静脉注入0.1ml生理盐水。治疗组致敏、激发同哮喘组，在d20天，治疗组经尾静脉注入0.1ml2×106个ADSCs/HO-1和ADSCs。对照组以生理盐水代替OVA，实验方法同哮喘组，在d20天，哮喘组经尾静脉注入0.1ml生理盐水。在d28天，各组小鼠在测定肺功能后，进行肺泡灌洗，再收集肺组织观察各组肺部病理变化情况，检测支气管肺泡灌洗液（Bronchoaleolarlavagefluid，BALF）中炎症细胞和细胞因子的变化情况，并检测HO-1在肺组织中的表达情况。结果：成功建立支气管哮喘小鼠模型。肺组织冰冻切片可以检测到绿色荧光蛋白的表达。与对照组相比，哮喘组肺功能为气道阻力增高、肺的顺应性下降，肺泡灌洗液中细胞总数明显升高，分类中嗜酸粒细胞也明显升高，细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、TNF-明显升高而细胞因子IFN-γ、IL-10明显降低，肺组织切片HE染色示气道周围有大量炎性细胞浸润，PAS染色示气道黏膜有较多杯状细胞增生，免疫组化染色示HO-1表达增加。治疗组能降低气道阻力、增加肺的顺应性，减少肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸粒细胞数，减少细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、TNF-，增加细胞因子IFN-γ、IL-10，减少气道周围炎性细胞浸润和气道黏膜的杯状细胞，增加肺组织HO-1的表达，与ADSCs组相比，ADSCs/HO-1组作用更明显，各组间差异有统计学意义。结论：用OVA致敏和激发可以成功建立小鼠哮喘模型。经尾静脉途径注入的小鼠ADSCs可以在小鼠肺部炎症的趋化下，迁移并定植于小鼠肺部。转染HO-1基因的ADSCs和单独注入ADSCs均能减轻小鼠的气道高反应、气管周围的炎性细胞浸润、气管黏膜杯状细胞增生，调节BALF中多种炎症介质如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-的产生，对支气管哮喘均有治疗作用，但转染HO-1基因的ADSCs作用更显著，HO-1在哮喘肺部具有抗炎作用。基因疗法治疗支气管哮喘是可行的。
【作者】朱灿红；
【导师】黄建安；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2014，博士
【关键词】小鼠；ADSCs；HO-1；慢病毒；基因治疗；支气管哮喘；动物模型；

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