肠道菌群实时荧光定量PCR方法的建立及在喘息急性发作期儿童中的变化

【摘要】目的：建立利用实时荧光定量PCR检测人粪便组织中双歧杆菌、乳酸杆菌含量的方法，为检测人肠道内菌群提供有效手段。同时检测处于喘息急性发作期的毛细支气管炎和支气管哮喘儿童粪便内双歧杆菌和乳酸杆菌含量变化，进一步探讨肠道菌群与呼吸系统疾病的关系。方法：所检测的粪便样本收集自2012年10月-2013年10月在吉林大学第一医院小儿呼吸一科住院的毛细支气管炎患儿和在喘息急性发作期的支气管哮喘患儿，其中支气管哮喘组为11例，毛细支气管炎组14例，对照组粪便样本来自小儿外科因血管瘤、疝气等择期手术的儿童及医护人员子女，共收集25例。提取粪便样本中细菌总DNA，选择细菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区设计细菌特异性引物，以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品。应用SYBRGreenⅠ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品及待测样本进行分析，建立绝对定量的标准曲线从而对样本中的乳酸杆菌、双歧杆菌进行定量。根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度；分析PCR产物溶解曲线评价反应特异性；重复检测梯度稀释的标准品，用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。通过应用建立的荧光定量PCR方法对粪便组织中的双歧杆菌和乳酸杆菌进行绝对定量，观察喘息急性发作期的患儿肠道内的双歧杆菌和乳酸杆菌含量变化，并分别比较毛细支气管炎组、支气管哮喘组与正常对照组儿童三组间双歧杆菌和乳酸杆菌含量的差别。应用SPSS16.0统计学软件对实验结果进行分析。结果：1.常规PCR反应扩增出双歧杆菌和乳酸杆菌16SrRNA部分基因片段测序结果正确，成功构建了双歧杆菌和乳酸杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品；生成的标准曲线r2均大于0.99；双歧杆菌和乳酸杆菌实时荧光定量PCR最低检测限度为分别为每个反应74.4个拷贝和142个拷贝；溶解曲线呈单峰；组间相同浓度标准品的Ct值变异系数小。2.喘息急性发作期的支气管哮喘儿童粪便内双歧杆菌含量与正常对照组对比含量减少，差异有统计学意义，p=0.02；乳酸杆菌含量变化检测无统计学意义，p=0.559。3.毛细支气管炎患儿粪便内双歧杆菌含量与正常对照组对比含量减少，差异有统计学意义，p=0.036；乳酸杆菌含量变化检测无统计学意义，p=0.935。4.对检测的50例儿童粪便中的双歧杆菌和乳酸杆菌进行相关性分析，两者无相关性，p=0.028，r2=0.097。结论：1.本研究所建立的实时荧光定量PCR反应敏感性高、特异性强和重复性好，适用于对人粪便中双歧杆菌和乳酸杆菌含量的检测。2.支气管哮喘儿童在喘息急性发作期存在肠道菌群的紊乱，主要表现为粪便内双歧杆菌含量减少，乳酸杆菌的变化无统计学意义。3.毛细支气管炎患儿肠道菌群变化趋势同支气管哮喘患儿一致。提示双歧杆菌含量的减少可能是毛细支气管炎演变为支气管哮喘过程中肠道菌群变化的早期靶标。4.同一儿童体内的双歧杆菌和乳酸杆菌分析无相关性，提示乳酸杆菌和双歧杆菌无协同或拮抗作用。
【作者】张力文；
【导师】张云峰；
【作者基本信息】吉林大学，儿科学，2014，硕士
【关键词】实时荧光定量PCR；毛细支气管炎；支气管哮喘；双歧杆菌；乳酸杆菌；

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