殊异韦荣菌sahH基因的克隆、重组蛋白表达和纯化

【摘要】韦荣菌（Veillonella）是一种革兰阴性厌氧小球菌，在口腔内主要寄生于黏膜、舌体和牙菌斑中，是牙菌斑中较早定植的常驻菌之一。口腔内各种细菌长期定居、生长繁殖、不断进行竞争和拮抗，这些活动主要是通过密度感应系统进行的。其中不同信号分子的产生就涉及到甲基循环。甲基循环中的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(sahH)是细胞内广泛存在的一种酶,能可逆地催化S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)水解生成腺苷(Ado)和同型半胱氨酸(Hcy)，参与细胞代谢过程中的甲基化作用。本实验提取殊异韦荣菌基因组DNA,利用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后，IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果显示韦荣菌中存在sahH,PCR扩增产物全长为1410bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在E.coliJM109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50000,而且诱导5h，蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4g·L-1。Westernblotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。通过实验从分子水平上探讨sahH甲基化机制及生理活性,了解信号传导通路和密度感应系统在口腔疾病中的作用，探讨口腔微生物环境之间的联系情况和致病机制，以期为龋病的预防和治疗扩展新的思路。
【作者】孙晓宇；
【导师】高心；
【作者基本信息】吉林大学，口腔临床医学，2014，硕士
【关键词】殊异韦荣菌；S-腺苷同型半胱氨酸水解酶；基因克隆；基因表达；纯化；

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