ApoE和iNOS敲除小鼠子痫前期动物模型的建立和胎盘功能异常的研究

【摘要】子痫前期(pre-eclampsia,PE)是在妊娠20周后出现的以高血压、蛋白尿和水肿为特征的妊娠期常见疾病,PE对母体和胎儿的健康造成较大的伤害,也是导致孕妇及围生儿发病和死亡的主要原因之一。目前对子痫前期发病机制国内外已经有较深较广泛的研究并提出多种学说,但任何一种学说都不能完全解释子痫前期的病因,在众多的子痫前期的发病机制中,内皮损伤学说越来越受到重视,认为血管内皮细胞损伤是子痫前期发病的中心环节。前期研究表明血管活性物质NO以及血脂代谢异常和内皮细胞功能异常有直接的关系。本实验拟用和脂代谢密切相关的载脂蛋白E(apolipoproteinE,ApoE)及和NO相关的诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)敲除小鼠研究子痫前期的发病机制。具体包括以下几个方面：首先通过ApoE基因敲除小鼠；iNOS基因敲除小鼠及ApoE、iNOS双基因敲除小鼠尝试建立子痫前期的动物模型。其次用HE染色和透射电镜法观察胎盘的病理变化和用WesternBlot法检测各组小鼠胎盘中和炎症相关蛋白及和凋亡相关蛋白的表达,从而阐明ApoE和iNOS导致的胎盘结构和功能的异常在子痫前期发病中的作用及可能机制。第一部分ApoE基因和子痫前期发病的关系第一节ApoE基因敲除小鼠子痫前期动物模型的建立目的：观察ApoE基因缺失后孕鼠是否存在血压升高,尿蛋白和胎儿宫内生长受限等子痫前期样症状的表现。方法：实验动物：ApoE-/-(ApoEdeficienthomozygote,ApoE基因缺失纯合子)小鼠和野生型小鼠(wildtype,WT)由南京模式动物中心直接获得,将ApoE-/-小鼠和WT小鼠交配得到ApoE+/-小鼠(ApoEdeficientheterozygote,ApoE基因缺失杂合子)。根据基因型将21只孕鼠分为ApoE-/-组,ApoE+/-组和WT组(各组N=7)。实验前用PCR(polymerasechainreaction)法扩增相应的基因片段测各组小鼠的基因型；将相同基因型的小鼠交配后,于妊娠第19天小鼠眼球取血,酶标法测定小鼠孕末期血脂：总胆固醇(totalcholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)。从妊娠开始每4天测量小鼠孕期尾动脉收缩血压,考马斯亮兰法从妊娠第4天开始每4天进行孕鼠孕尿蛋白定量,于第19天剖宫产取出胎鼠称量胎鼠出生体重、胎盘重量比较各组小鼠孕期生理指标的变化。结果：①ApoE-/-组小鼠基因PCR扩增显示特征性片段,鉴定实验用小鼠基因为ApoE基因缺失纯合子和杂合子；小鼠妊娠末期ApoE-/-组和WT组相比血清TC、TG、LDL明显升高但HDL水平明显下降(P<0.05或0.01)。小鼠妊娠末期血压(第12天129.3±15.7mmHg,第16天121.7±5.8mmHg)升高及尿蛋白水平(455.3±107.2mg/L)高于WT小鼠(P<0.05)；胎鼠体重(1004±130mg)和胎盘重量(110±7.2mg)均小于WT组(P<0.01)。②ApoE+/-组小鼠基因PCR扩增显示特征性片段;TG高于WT组(P<0.05),TC,HDL,LDL均没有明显改变(P>0.05)。ApoE+/-组妊娠期血压、蛋白尿及胎鼠体重和胎盘重量和WT组相比无统计学差异(P>0.05)。结论：ApoE-/-小鼠出现子痫前期症状,ApoE在子痫前期的发病中起到重要作用。第二节ApoE敲除小鼠胎盘炎症及凋亡相关蛋白表达的变化目的：观察胎盘凋亡及炎症反应的变化探寻其可能的发病机制。方法：首先胎盘HE染色观和透射电镜方法观察胎盘宏观和微观结构变化；再用WesternBlot法检测胎盘肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介-6(interleukin-6,IL-6)、核因子转录因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB),和凋亡相关蛋白bax、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcelllymphoma/lewkmia-2,BCL-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达水平,观察和比较三组小鼠胎盘炎症反应及凋亡情况。结果：①HE染色观察到ApoE-/-小鼠胎盘细胞的肿胀和坏死,电镜下观察胎盘绒毛血管内皮与WT组相比有明显细胞器形态改变和染色质异常。ApoE-/-妊娠鼠胎盘组织中炎症相关因子IL-6(0.917±0.153).TNF-α(0.453±0.020)、NF-κb(1.602±0.234)和凋亡相关蛋白Bax(0.789±0.149)、bcl-2(0.977±0.349),Caspase-3(2.132±0.173)的表达以及Bax/bcl-2(0.897±0.301)比值均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。②ApoE+/-组胎盘HE染色光镜下观察和电镜下观察均没有发现明显异常。胎盘除TNF-α和表达高于WT组外,Bcl-2,TNF-α,Caspase-3,IL-6、NF-κB表达和WT组没有差异。结论：ApoE小鼠胎盘部位的炎症反应及细胞凋亡可能在子痫前期的发病中起到重要作用。第二部分iNOS基因与子痫前期发病的关系目的：观察iNOS基因缺失后孕鼠是否存在血压升高,尿蛋白和胎儿宫内生长受限等子痫前期样症状的表现。并观察胎盘细胞凋亡及炎症反应探寻其可能的发病机制。方法：实验动物：iNOS;(iNOSdeficienthomozygote,iNOS基因缺失纯合子)小鼠和WT小鼠由南京模式动物中心直接获得,将iNOS-/-小鼠和野生型小鼠(wildtype,WT)小鼠交配得至JiNOS+/-小鼠(iNOSdeficientheterozygote,基因缺失杂合子)。根据基因型将21只孕鼠分为iNOS-/-组,iNOS+/-组和WT小鼠组(各组N=7)。实验前用PCR法检测小鼠基因型。将基因型相同的雌鼠和雄鼠交配后,从妊娠0天开始每四天测量小鼠孕期尾动脉收缩血压,考马斯亮兰法从妊娠第4天开始每4天进行孕鼠孕尿蛋白定量,于第19天剖宫产取出胎鼠称量胎鼠出生体重、胎盘重量比较各组小鼠孕期生理指标的变化。硝酸还原法测定小鼠血清和胎盘中NO浓度。胎盘HE染色和透射电镜方法观察胎盘宏观和微观结构变化；用WesternBlot法检测胎盘TNF-α、IL-6、NF-κB和凋亡相关蛋白bax、BCL-2、caspas-3表达水平,观察和比较三组小鼠胎盘炎症反应及凋亡情况。结果：①iNOSE-/-组PCR扩增显示特征性片段,鉴定小鼠基因型为iNOS基因缺失纯合子和杂合子。iNO小鼠孕期血压尿蛋白水平,胎盘和胎鼠重量及血清胎盘NO水平和WT相比没有统计学意义。iNO组电镜下和HE染色均可见胎盘毛细血管增生。iNOS-/-组除了胎盘NF-κb的蛋白的表达高于WT组(P<0.05)但TNF-α、bax、IL-6、caspase-3表达及Bax/Bcl-2和WT组相比无明显差(P>0.05)。②iNOS+/-组PCR扩增显示特征性片段,iNOS+/-小鼠孕期血压尿蛋白水平,胎盘和胎鼠重量及血清胎盘NO水平和WT相比也没有统计学意义。iNOS+/-组和WT相比电镜下结构无明显差别,除了Bcl-2表达高于WT组外(P<0.05)。TNF-α、IL-6、NF-κB、Bax、caspase-3的表达和WT组相比无明显差别。结论：iNOS敲除小鼠没有出现子痫前期,iNOS基因和子痫前期之间没有直接的联系。第三部分ApOE和iNOS基因的相互作用及与子痫前期发病的关系目的：观察iNOS和ApoE基因都缺失后孕鼠是否发生血压升高,尿蛋白和胎儿宫内生长受限等子痫前期样症状的表现,并观察胎盘凋亡及炎症反应探寻这两种基因的联合作用在子痫前期发病中的作用。方法：ApoE和iNOS双基因敲除小鼠由ApoE和liNOS单基因敲除小鼠,交配得到ApoE+/-iNOS+/-小鼠(双杂合子小鼠),再进一步杂交得到纯合子ApoE-/-iNOS-/-小鼠(iNOS,ApoE双基因敲除纯合子小鼠)：根据小鼠基因型分为ApoE-/–组,iNOS-/-组,ApoE-/-iNOS-/和WT组各组(N=7).PCR验证各组小鼠的基因型。实验前用PCR法扩增相应的基因片段测各组小鼠的基因型,酶标法测定小鼠孕末期血脂,硝酸还原法测定小鼠血清和胎盘中NO浓度；将相同基因型的雌鼠和雄鼠交配后,从妊娠0开始每4天测量小鼠孕期尾动脉收缩血压,考马斯亮兰法从妊娠第4天开始每4天进行孕鼠孕尿蛋白定量,于第19天剖宫产取出胎鼠称量胎鼠出生体重、胎盘重量比较各组小鼠孕期生理指标的变化。胎盘HE染色和透射电镜方法观察胎盘宏观和微观结构；用WesternBlot法检测胎盘肿瘤坏死因子TNF-α、IL-6、NF-κB,和凋亡相关蛋白bax、BCL-2、caspase-3表达水平,观察和比较三组小鼠胎盘炎症反应及凋亡情况。结果：①PCR扩增片段证实为ApoE基因敲除和iNOS基因敲除的特征片段,证实小鼠为ApoE和iNOS双基因敲除小鼠。ApoE-/-iNOS-/-组血清血脂变化显著TG、TC、LDL明显升高而HDL则降低(P<0.01)；ApoE-/-iNOS-/-组TG、LDL水平高于和ApoE-/-组而HDL则有所下降(P<0.05).ApoE-/-iNOS-/-胎盘和血清NO浓度均低于ApoE-/-组(P<0.05).ApoE-/-iNOS-/-组胎盘NO(10.5±1.9μmol/g)血清NO浓度(14.2±1.6μmol/L)氏于WT组和ApoE-/-组(VSWT:P<0.01:V.SApoE-/-P＜0.05).ApoE-/-iNOS-/-孕期血压呈逐渐上升趋势,血压妊娠第4天血压(117.9±13.4mmHg)就开始高于WT组(P<0.05),随着妊娠的发展血压逐渐上升,且在孕末期高于ApoE-/-组(P<0.05)。孕末期尿蛋白第(第12天432.7±63.56mg/L第16天603±73.18mg/L)高于WT(P<0.05和P<0.01),且高于ApoE/-组(P<0.05)。小鼠胎盘重量胎鼠体重不仅低于WT组(P<0.01),也低于ApoE-/–组(P<0.05)。②ApoE-/-NOS-/-组HE染色见胎盘有显著胎盘细胞凋亡和毛细血管壁损伤,电镜下见胎盘血管内皮细胞损伤和滋养细胞凋亡显现象。炎症相关蛋白：ApoE-/-iNOS-/-组IL-6(0.744±0.101)、TNF-α(0.683±0.102)、NF-κB(2.376±0.259)的表达均明显高于WT组(P<0.01或P<0.05).ApoE-/-iNOS-/-组TNF-α、NF-κB的表达高于ApoE-/-组(P<0.05),但IL-6的表达低于ApoE-/-组,但无统计学意义(P>0.05)。凋亡相关蛋白：ApoE-/-iNOS-/-组胎盘Bax(1.692±0.214)、Bcl-2(0.405±0.099).Caspase-3(2.438±0.520)及Bax/Bcl-2(4.409±1.580)比值均明显高于WT组(P<0.01或P<0.05)。且Bax的表达及Bax/Bcl-2比值高于ApoE-/-(P<0.05),Bd-2及caspase-3的表达水平和ApOE-/-组相比无明显差别(P<0.05)。结论：ApoE-/-iNOS-/-小鼠子痫前期样症状加重,iNOS在子痫前期的疾病的发展的中起到一定的保护作用。
【作者】毛路一；
【导师】李笑天；
【作者基本信息】复旦大学，妇产科学（专业学位），2011，博士
【关键词】载脂蛋白E；诱导型一氧化氮合酶；子痫前期；基因敲除小鼠；Westernblot；胎盘细胞凋亡；炎症反应；动物模型；

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