药物代谢酶的生物质谱绝对定量方法发展及其应用研究

【摘要】研究目的基于定量蛋白质组学的研究方法，利用液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS），建立测定大鼠和人肝微粒体中药物代谢酶亚型的分析方法，然后通过制备并测定大鼠和人的肝微粒体样本，获得肝微粒体中各药物代谢酶亚型的表达水平数据，同时和传统探针法进行对照，为药物研发和临床安全用药过程中药物代谢酶的研究提供新的途径。研究方案通过对7种大鼠药物代谢酶CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1理论胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列的分析，确定能代表各药物代谢酶亚型的特征肽段，人工合成特征肽段标准品；利用液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS），通过优化液相色谱流动相组成、洗脱梯度，离子源等相关质谱参数，采用多反应监测模式，建立针对特征肽段的LC-MS/MS检测方法；通过选择合适的酶浓度和酶解时间并采用固相萃取过程确定肝微粒体样品的制备方法；实验中制备含有肝微粒体基质的溶液，并合成稳定同位素标记的特征肽段，考察基质对建立特征肽段的标准工作曲线的影响；最后，通过测定大鼠肝微粒体样本，得到药物代谢酶表达水平数据。通过对7种人的P450酶CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1的理论胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列进行分析，确定能代表各P450酶亚型的特征肽段，人工合成具有相同序列的稳定同位素标记的特征肽段标准品；利用液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS），采用多反应监测模式，建立针对特征肽段与其稳定同位素标记肽段的LC-MS/MS定量方法；制备并测定12例人肝微粒体样本，得到相关P450酶亚型含量的数据；分别以蟾蜍灵（Bufalin）和咪达唑仑（Midazolam）为探针底物，进行肝微粒体孵育，得到CYP3A酶活性数据，将CYP3A4和CYP3A5酶含量数据和酶活性数据进行相关性分析，考察新的探针底物蟾蜍灵的底物专一性以及所得P450酶含量数据的准确性。设计一种带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标。首先考察带有酶切位点肽段的酶解过程。然后以鼠源肝微粒体中药物代谢酶CYP2A1、CYP2D26和UGT1A1为研究对象，以三种不同的形式加入同位素标记内标肽段。考察以三种形式加入内标肽段对测定结果的影响，同时考察了酶解过程时间长短对测定结果的影响。研究结果本研究确定代表大鼠CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1酶的特征肽段序列依次为GNPESSFNDANLR、YIDFVPIPLPR、VHEEIEQVIGR、FADIVPTNIPHMTSR、IILNELAQR、LLDVWTYELPR、SVFDQDPFLLR，用于多反应监测定量的离子对依次为m/z711.1/625.5、665.6/692.4、437.0/345.2、567.2/577.4、535.5/843.5、702.7/964.5、669.1/645.1，用于定量的标准工作曲线依次为y=820x+1560（r=0.9982）、y=904x–733（r=0.9977）、y=1190x–7210（r=0.9985）、y=1170x–3330（r=0.9993）、y=509x–567（r=0.9996）、y=222x–720（r=0.9981）、y=835x–2420（r=0.9969），测得的酶含量依次为11.77、15.80、26.82、18.30、11.47、27.17和17.30pmol/mgprotein。以合成的稳定同位素标记特征肽段作为内标，对UGT1A1进行定量，结果显示，特征肽段与其同位素标记肽段色谱行为与质谱响应一致，在基质溶液中同位素标记肽段线性关系良好，利用标准曲线法和稳定同位素标记肽段作为内标法测得UGT1A1含量分别为17.30pmol/mgprotein和18.23pmol/mgprotein，两种方法所得结果基本一致，但以稳定同位素标记肽段作为内标法操作简便，更适用于复杂样品的高通量测定。本研究确定代表人CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1酶的特征肽段序列依次为YLPNPALQ、FSVTTMR、EVTNFLR、SLGPVGFMK、SHMPYTDAVVHEVQR、HFPLAER、GIIFNNGPTWK，测得酶的平均含量依次为39.3、4.3、54.0、4.6、10.3、3.0和9.3pmol/mgprotein；不同P450亚型的表达水平差别较大，同一P450亚型存在明显的个体差异；吸烟个体中CYP1A2的表达水平稍高，其他酶的表达水平稍低；相关性分析结果可知，以蟾蜍灵为底物测得的酶活性数据与CYP3A4含量数据相关性最好，作为CYP3A4底物，蟾蜍灵的专一性比咪达唑仑更强。同时说明，本实验建立的人P450亚型绝对定量方法准确可靠。实验结果表明，当肽段的酶切位点两端分别增加3个氨基酸时，该带有酶切位点的肽段就能够被胰蛋白酶水解。选用带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标时，可以提高测定结果的准确度和精密度。适当延长酶解过程的时间，有利于提高测定结果的准确度。通过以上三部分实验，建立了针对药物代谢酶的定量分析方法，为药物相关领域中药物代谢酶的研究提供了新的途径。
【作者】刘喜东；
【导师】胡良海；顾景凯；
【作者基本信息】吉林大学，药物分析，2014，硕士
【关键词】药物代谢酶；定量蛋白质组学；液相色谱-质谱联用技术；多反应监测；绝对定量；

【参考文献】
[1]顾妙恩.追梦,在路上[J].宁波通讯,2014,15:76-77.
[2]胡江龙.生物式水质监测中目标跟踪和预警分析的研究[D].杭州电子科技大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[3]吴映波.适合现代远程教育的安全多播机制研究及实现[D].重庆大学,计算机系统结构,2003,硕士.
[4]衡丽娜.脂肪族聚脲弹性体及其纳米复合材料的制备[D].大连海事大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[5]胡春裕.支持同族产品快速设计技术的理论研究及其实现[D].上海海洋大学,机械工程,2013,硕士.
[6]吴那仁朝格图.搏克竞赛规则演变研究[D].内蒙古师范大学,民族传统体育学,2012,硕士.
[7]赵舒颖.中日股东代表诉讼当事人问题比较研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[8]王冲.新形势下检察机关贯彻群众路线之研究[D].河北经贸大学,思想政治教育,2014,硕士.
[9]于灏.路由器中CAM控制器的设计与验证[D].哈尔滨工业大学,集成电路工程,2014,硕士.
[10]黄玉洁.Feller链的收敛性及平稳分布的存在性[D].湖北大学,概率论与数理统计,2011,硕士.
[11]庄乐.肿瘤坏死因子α-308位点基因多态性与银屑病易感性的荟萃分析[D].山东大学,皮肤性病学（专业学位）,2013,硕士.
[12]韩宁.100吨汽车起重机底盘混合悬架系统设计与分析[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[13]王计锁.开滦集团公司非煤产业发展策略研究[D].天津大学,2003.
[14]张好圆.民营企业管理层股权激励与公司业绩的循环推动效应研究[D].燕山大学,会计学,2013,硕士.
[15]王炳波.复杂网络拓扑结构度量指标及应用研究[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2014,博士.
[16]吴雪莹.一类离散奇异生态经济系统的稳定性及分支分析[D].湖北师范学院,应用数学,2013,硕士.
[17]杨虎,戈长水,应武,杨京平,李金文,何俊俊.遮荫对水稻冠层叶片SPAD值及光合、形态特性参数的影响[J].植物营养与肥料学报,2014,03:580-587.
[18]吴雪娟.我国高校内部控制体系研究[D].湖北工业大学,会计学,2014,硕士.
[19]胡振华.聚环氧乙烷对脓毒血症休克大鼠脊斜肌微循环影响的实验研究[D].南方医科大学,麻醉学,2012,硕士.
[20]胡薇.区级政府经济管理职能探讨[D].宁波大学,政府管理（专业学位）,2014,硕士.
[21]胡文彬.“抽象名词+上”的附缀化现象研究[D].华中师范大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[22]徐贝贝.面向异构织机的实时数据采集研究与应用[D].浙江理工大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[23]尚富国.基于企业价值评估模型的我国资本市场有效性分析[D].新疆财经大学,金融学,2013,硕士.
[24]彭向峰.电子商务平台—购物网站的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[25]单凌寒.中国女性社会学研究发展历程及反思[D].黑龙江大学,社会学,2013,硕士.
[26]吕飞,沈军樑,金炉俊,丁玉庭,尤国庭.鱼皮酶法去鳞技术的研究[J].浙江农业科学,2013,07:872-874+916.
[27]程昌熟.外包钢筋混凝土加固柱正截面承载力理论分析[D].湖南大学,结构工程,2003,硕士.
[28]邹芹.纳米金刚石结构、表面状态分析及其处理方法[D].燕山大学,材料学,2004,硕士.
[29]刘亮.花生壳厌氧发酵制取沼气试验研究[D].河南农业大学,农业生物环境与能源工程,2012,硕士.
[30]张锦凤.电子秤与计算机联机运行的故障判断及对策[J].冶金自动化,1993,05:29-32+59.
[31]迟欢.基于TR-069的HeNB自配置系统的设计与实现[D].南京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[32]王凯.基于粗集理论的工程项目管理指标及其体系研究[D].北京交通大学,2012.
[33]李桔松.清末民初三多诗词研究[D].内蒙古大学,中国古代文学,2013,硕士.
[34]姜鑫.生物信息学数据库及其利用方法[J].现代情报,2005,06:185-187.
[35]韦登亮.概念融合理论及其在《红楼梦》隐喻翻译中的应用[D].大连理工大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[36]孔德宝.多年冻土地区挡土墙监测研究与数值模拟计算[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[37]梁新彧.HSK动态作文语料库中留学生习得“一直”的调查研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[38]朱光,胡召齐,陈印,牛漫兰,谢成龙.华北克拉通东部早白垩世伸展盆地的发育过程及其对克拉通破坏的指示[J].地质通报,2008,10:1594-1604.
[39]孙小淋.结实期干—湿交替灌溉对水稻产量和品质的影响及其生理机制[D].扬州大学,作物栽培学与耕作学,2011,硕士.
[40]周晓根,张贵军,郝小虎.局部抽象凸区域剖分差分进化算法[J].自动化学报.
[41]龙艳艳.基于OFDM的协作无线传输技术研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[42]周保平.北宋时期河南书院考证及其兴盛原因探析[J].河南大学学报(社会科学版),2014,05:115-120.
[43]解加全.Block Pulse函数法求解一类非线性Fredholm-Volterra积分微分方程[D].燕山大学,计算数学,2013,硕士.
[44]段新民,陈清华,李琴.石油勘探开发数据信息与数据挖掘[J].情报杂志,2004,07:111-112.
[45]陈燕.我国产品责任保险发展模式研究[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[46]乔顺风.水体氨氮转化形式与调控利用的研究[J].饲料工业.2005(12)
[47]夏红霞,水俊峰,钟珞,马志军.基于SOAP的分布式数据挖掘系统的设计[J].武汉理工大学学报,2003,01:73-76.
[48]俞英豪.不同生境下大青叶蝉肠道细菌多样性研究[D].南京农业大学,微生物学,2012,硕士.
[49]李杏莉,王彦春,刘力辉,刘保国.基于地震资料高阶统计量的含油气储层非均质性研究——鄂尔多斯盆地大牛地气田储层预测实例[J].石油地球物理勘探,2009,03:314-318+386+252.
[50]于泠.网络攻击的有效防范技术研究[D].南京师范大学,2002.